一种生产L-苏氨酸的方法[发明专利]

*CN102304553A*

(10)申请公布号 CN 102304553 A(43)申请公布日 2012.01.04

(12)发明专利申请

(21)申请号 201110279419.1(22)申请日 2011.09.20(83)生物保藏信息

CGMCC No.5180 2011.08.26

(71)申请人中国科学院微生物研究所

地址100101 北京市朝阳区北辰西路1号院

3号(72)发明人刘树文 温廷益 陈宁 梁勇

刘茜 陶桐桐(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限

公司 11245

代理人关畅(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C12R 1/19(2006.01)

C12P 13/08(2006.01)

权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 3 页

()发明名称

一种生产L-苏氨酸的方法(57)摘要

本发明公开了一种生产L-苏氨酸的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：将具有生产L-苏氨酸能力的菌株进行发酵培养，得到L-苏氨酸；所述发酵培养过程中，菌体生长量不再增加以前作为第一阶段，菌体生长量不再增加作为第二阶段；所述第一阶段中，以实现所述菌株的最优比生产速率为前提采用指数补料的方式在发酵培养体系中加入营养成分；所述第二阶段中，以实现所述菌株生产L-苏氨酸的最大生产速率为前提采用恒速补料的方式在发酵培养体系中加入营养成分。本发明的优点在于：便于实现精确控制和优化控制；可操作性强，便于生产过程的实时；可进一步提高生产效率。本发明对于L-苏氨酸工业化生产具有非常重要的意义。

CN 102304553 ACN 102304553 ACN 102304559 A

权 利 要 求 书

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1.一种生产L-苏氨酸的方法，包括如下步骤：

将具有生产L-苏氨酸能力的菌株进行发酵培养，得到L-苏氨酸；所述发酵培养过程中，菌体生长量不再增加以前作为第一阶段，菌体生长量不再增加以后作为第二阶段；所述第一阶段中，以实现所述菌株的最优比生产速率为前提采用指数补料的方式在发酵培养体系中加入营养成分；所述第二阶段中，以实现所述菌株生产L-苏氨酸的最大生产速率为前提采用恒速补料的方式在发酵培养体系中加入营养成分；

所述第一阶段中，所述最优比生产速率为比生产速率的最大值；所述比生产速率＝(所述第一阶段终止时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度-所述第一阶段初始时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度)÷(所述第一阶段初始时刻发酵液中菌体干重与所述第一阶段终止时刻发酵液中菌体干重的算数平均值×所述第一阶段经历的时间)；

所述第二阶段中，所述生产速率＝(所述第二阶段终止时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度-所述第二阶段初始时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度)÷所述第二阶段经历的时间。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述营养成分为碳源、氮源、磷源、硫源、镁源、钾源和氨基酸中的至少一种；

所述营养成分优选为如下(a)或(b)：(a)氨基酸和磷源；(b)氨基酸；所述(a)中，所述氨基酸更加优选为异亮氨酸，最优选为L-异亮氨酸，所述磷源更加优选为磷酸二氢钾；

所述(b)中，所述氨基酸更加优选为异亮氨酸，最优选为L-异亮氨酸。3.一种生产L-苏氨酸的方法，包括如下步骤：将具有生产L-苏氨酸能力的菌株进行发酵培养，得到L-苏氨酸；所述发酵培养过程中，菌体生长量不再增加以前作为第一阶段，菌体生长量不再增加以后作为第二阶段；

所述第一阶段的发酵过程中将补料液甲通过如下程序控制发酵罐进行指数补料：F＝(μ·X0·V0·eμt)/(S·Yile/X)，其中F为指数补料速率，μ为比生长速率，X0为初始菌体浓度，V0为初始发酵液体积，e为自然对数，t为所述第一阶段的发酵时间，S为所述补料液甲中的L-异亮氨酸浓度，Yile/X为细胞得率；所述程序中，μ的数值设定以实现所述菌株的最优比生产速率为前提；所述补料液甲为L-异亮氨酸水溶液或L-异亮氨酸和磷酸二氢钾的水溶液；

所述第二阶段的发酵过程中将补料液乙进行恒速补料，以实现所述菌株生产L-苏氨酸的最大生产速率为前提设定L-异亮氨酸的恒速补料的速率；所述补料液乙为L-异亮氨酸水溶液；

所述第一阶段中，所述最优比生产速率为比生产速率的最大值；所述比生产速率＝(所述第一阶段终止时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度-所述第一阶段初始时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度)÷(所述第一阶段初始时刻发酵液中菌体干重与所述第一阶段终止时刻发酵液中菌体干重的算数平均值×所述第一阶段经历的时间)；

所述第二阶段中，所述生产速率＝(所述第二阶段终止时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度-所述第二阶段初始时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度)÷所述第二阶段经历的时间。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述第一阶段的所述程序中，μ的取值范围为0.05h-1-0.5h-1，优选为0.12h-1-0.21h-1，最优选为0.16h-1；所述第二阶段中，所述L-异亮氨酸的恒速补料速率为0g·L-1·h-1-10g·L-1·h-1，优选为0g·L-1·h-1-5g·L-1·h-1，最

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权 利 要 求 书

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优选为1.5mg·L-1·h-1。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述第一阶段的所述程序中，Yile/X＝107g/g。

6.如权利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于：所述第一阶段的所述程序中，X0

＝3g·L-1，V0＝2.2L，e＝2.718，S＝2g/L；

所述第一阶段的初始时刻的发酵体系的制备方法为：将所述具有生产L-苏氨酸能力的菌株的菌液接种于发酵罐中的发酵初始培养基，培养至每升发酵液中含有3g菌体，共得到2.2L发酵液。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：当所述补料液甲为L-异亮氨酸水溶液时，所述发酵初始培养基是将10g葡萄糖、10g硫酸铵、2g磷酸二氢钾、2g硫酸镁、2g酵母粉和2mL微量元素混合液定容至1L得到的；所述L-异亮氨酸水溶液中L-异亮氨酸的浓度为2g/L；

当所述补料液甲为L-异亮氨酸和磷酸二氢钾的水溶液时，所述发酵初始培养基是将10g葡萄糖、10g硫酸铵、2g硫酸镁、2g酵母粉和2mL所述微量元素混合液定容至1L得到的；所述L-异亮氨酸和磷酸二氢钾的水溶液中，L-异亮氨酸的浓度为2g/L，磷酸二氢钾的浓度为10g/L；

所述微量元素混合液是将10g FeSO4·7H2O、1.35g CaCl2、2.25g ZnSO4·7H2O、0.5gMnSO4·4H2O、1g CuSO4·5H2O、0.106g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.23g Na2B4O7·10H2O、0.48gCoCl2·6H2O和10ml 35％HCl水溶液定容至1L得到的。

8.如权利要求3至7中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为37℃、pH为6.8、溶氧为50％。

9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述具有生产L-苏氨酸能力的菌株为保藏编号为CGMCC No.5180的大肠埃希氏菌EC125。

10.大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EC125，它的保藏编号为CGMCC No.5180。

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说 明 书

一种生产L-苏氨酸的方法

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技术领域

[0001]

本发明涉及一种生产L-苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸是一种必需氨基酸，广泛应用于医药、食品、动物饲料等方面。近年来，国内外市场对L-苏氨酸的需求量逐年增长。目前，生产L-苏氨酸的主要方法是发酵法。发酵过程的改进可以提高氨基酸的生产效率，降低生产成本，减少环境污染。因此，发酵过程对于L-苏氨酸工业化生产具有非常重要的现实意义。

[0003] 发酵法生产L-苏氨酸的方式主要有分批(或间歇)发酵、连续发酵和补料分批发酵三种。补料分批发酵可以克服分批发酵初始底物浓度过高带来的渗透压或成分比例不当造成的低生产效率，同时还可以克服连续发酵易染菌、菌种易老化和变异等缺点，成为L-氨基酸工业生产的主要方式。迄今为止，已经开发的应用于L-苏氨酸补料分批发酵过程的方法主要包括发酵条件(包括溶氧、温度、pH)和补料过程两个方面。[0004] 虽然上述补料过程技术可以在一定程度上提高氨基酸发酵的生产效率，但是还存在以下问题和不足之处：部分现有技术方案强虽然强调补加某些成分会提高发酵生产效率，但是没有提供明确的补料过程控制方法；部分现有技术方案虽然提供了一些简单的补料过程控制方法，但是这些控制方法缺乏补料依据，无法实现精确和优化控制；部分现有技术以发酵条件参数(如pH)为补料过程控制依据进行间歇法补料，但是无法实现连续的精确控制；部分现有技术以发酵培养液中的某些成分(如硫酸盐、氨基酸)的浓度作为补料过程控制的依据，但是这些成分的测定方法复杂、耗时、操作性差，不利于补料过程的实时控制。

[0002]

发明内容

本发明的目的是提供一种生产L-苏氨酸的方法。

[0006] 本发明提供的生产L-苏氨酸的方法，包括如下步骤：[0007] 将具有生产L-苏氨酸能力的菌株进行发酵培养，得到L-苏氨酸；所述发酵培养过程中，菌体生长量不再增加以前作为第一阶段，菌体生长量不再增加作为第二阶段；所述第一阶段中，以实现所述菌株的最优比生产速率为前提采用指数补料的方式在发酵培养体系中加入营养成分；所述第二阶段中，以实现所述菌株生产L-苏氨酸的最大生产速率为前提采用恒速补料的方式在发酵培养体系中加入营养成分；[0008] 所述第一阶段中，所述最优比生产速率为比生产速率的最大值；所述比生产速率(g·g-1·h-1)＝(所述第一阶段终止时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度-所述第一阶段初始时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度)÷(所述第一阶段初始时刻发酵液中菌体干重与所述第一阶段终止时刻发酵液中菌体干重的算数平均值×所述第一阶段经历的时间)；[0009] 所述第二阶段中，所述生产速率(g·L-1·h-1)＝(所述第二阶段终止时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度-所述第二阶段初始时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度)÷所述第二阶段

[0005]

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说 明 书

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经历的时间。

[0010] 所述营养成分可为碳源、氮源、磷源、硫源、镁源、钾源和氨基酸中的至少一种。所述营养成分优选为如下(a)或(b)：(a)氨基酸和磷源；(b)氨基酸。所述(a)中，所述氨基酸更加优选为异亮氨酸，最优选为L-异亮氨酸，所述磷源更加优选为磷酸二氢钾。所述(b)中，所述氨基酸更加优选为异亮氨酸，最优选为L-异亮氨酸。本发明提供的另一种生产L-苏氨酸的方法，包括如下步骤：[0012] 将具有生产L-苏氨酸能力的菌株进行发酵培养，得到L-苏氨酸；所述发酵培养过程中，菌体生长量不再增加以前作为第一阶段，菌体生长量不再增加以后作为第二阶段；[0013] 所述第一阶段的发酵过程中将补料液甲通过如下程序控制发酵罐进行指数补料：F＝(μ·X0·V0·eμt)/(S·Yile/X)，其中F为指数补料速率，μ为比生长速率，X0为初始菌体浓度，V0为初始发酵液体积，e为自然对数，t为所述第一阶段发酵时间，S为所述补料液甲中的L-异亮氨酸浓度，Yile/X为细胞得率；所述程序中，μ的数值设定以实现所述菌株的最优比生产速率为前提；所述补料液甲为L-异亮氨酸水溶液或L-异亮氨酸和磷酸二氢钾的水溶液；

[0014] 所述第二阶段的发酵过程中将补料液乙进行恒速补料，以实现所述菌株生产L-苏氨酸的最大生产速率为前提设定L-异亮氨酸的恒速补料的速率；所述补料液乙为L-异亮氨酸水溶液；

[0015] 所述第一阶段中，所述最优比生产速率为比生产速率的最大值；所述比生产速率(g·g-1·h-1)＝(所述第一阶段终止时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度-所述第一阶段初始时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度)÷(所述第一阶段初始时刻发酵液中菌体干重与所述第一阶段终止时刻发酵液中菌体干重的算数平均值×所述第一阶段经历的时间)；[0016] 所述第二阶段中，所述生产速率(g·L-1·h-1)＝(所述第二阶段终止时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度-所述第二阶段初始时刻发酵液中L-苏氨酸的浓度)÷所述第二阶段经历的时间。

[0017] 所述第一阶段的所述程序中，μ的取值范围为0.05h-1-0.5h-1，优选为0.12h-1-0.21h-1，最优选为0.16h-1；所述第二阶段中，所述L-异亮氨酸的恒速补料速率为0g·L-1·h-1-10g·L-1·h-1，优选为0g·L-1·h-1-5g·L-1·h-1，最优选为1.5mg·L-1·h-1。[0018] 所述第一阶段的所述程序中，可取如下数值：Yile/X＝107g/g。[0019] 所述第一阶段的所述程序中，可取如下数值：X0＝3g·L-1，V0＝2.2L，e＝2.718，S＝2g/L；

[0011]

所述第一阶段的初始时刻的发酵体系的制备方法为：将具有生产L-苏氨酸能力

的菌株(如大肠埃希氏菌EC125)的菌液接种于发酵罐中的发酵初始培养基，培养至每升发酵液中含有3g菌体(干重)，共得到2.2L发酵液。[0021] 当所述补料液甲为L-异亮氨酸水溶液时，所述发酵初始培养基具体可为将10g葡萄糖、10g硫酸铵、2g磷酸二氢钾、2g硫酸镁、2g酵母粉和2mL微量元素混合液定容至1L得到的培养基；所述L-异亮氨酸水溶液中L-异亮氨酸的浓度具体可为2g/L。[0022] 当所述补料液甲为L-异亮氨酸和磷酸二氢钾的水溶液时，所述发酵初始培养基具体可为将10g葡萄糖、10g硫酸铵、2g硫酸镁、2g酵母粉和2mL所述微量元素混合液定容至1L得到的培养基；所述L-异亮氨酸和磷酸二氢钾的水溶液中，L-异亮氨酸的浓度具体

[0020]

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说 明 书

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可为2g/L，磷酸二氢钾的浓度具体可为10g/L。

[0023] 所述微量元素混合液具体可为将10g FeSO4·7H2O、1.35g CaCl2、2.25gZnSO4·7H2O、0.5g MnSO4·4H2O、1g CuSO4·5H2O、0.106g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.23gNa2B4O7·10H2O、0.48g CoCl2·6H2O和10ml 35％(体积比)HCl水溶液定容至1L得到的溶液。

[0024] 所述发酵的温度可为37℃、pH可为6.8、溶氧可为50％。

[0025] 所述具有生产L-苏氨酸能力的菌株具体可为大肠埃希氏菌EC125。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EC125已于2011年08月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5180。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EC125CGMCC No.5180简称大肠埃希氏菌EC125。

[0026] 所述大肠埃希氏菌EC125菌液接种于发酵罐中的所述发酵初始培养基时，接种量具体可为3％(体积比)。

[0027] 所述大肠埃希氏菌EC125的菌液的制备方法具体如下：[0028] (1)将大肠埃希氏菌EC125划线接种于LB培养基平板，置于37℃培养箱中培养12h；

[0029] (2)挑取步骤(1)的单菌落转接入3mL液体LB培养基，置于37℃摇床180rpm培养12h；

[0030] (3)取步骤(2)的菌液按3％接种量(体积比)转接入30mL种子培养基置于37℃摇床220rpm培养12h，得到大肠埃希氏菌EC125菌液(OD600＝8.5)。[0031] 所述种子培养基可为种子培养基甲或种子培养基乙。[0032] 所述种子培养基甲由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：葡萄糖40g/L，硫酸铵15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉2g/L，L-异亮氨酸0.05g/L，碳酸钙15g/L，微量元素混合液2mL/L。

[0033] 所述种子培养基乙由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：葡萄糖40g/L，硫酸铵15g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉2g/L，L-异亮氨酸0.05g/L，碳酸钙15g/L，微量元素混合液2mL/L。

[0034] 所述指数补料具体是通过BioCommand Plus生物过程软件控制所述发酵罐实现的。

[0035] 所述发酵罐具体可为7.5L发酵罐(115，NBS)。该发酵罐内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料；也可以通过BioCommand Plus生物过程软件实现指数补料。[0036] 所述发酵培养的整个过程中：可通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；可通入空气提供溶氧，必要时按1∶1的比例(体积比)通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；可通过补加25％(体积比)氨水pH维持在6.8。[0037] 所述第一阶段的时间具体可为7-20小时，优选为10.5-11小时。[0038] 所述第二阶段进行至L-苏氨酸的生产速率低于0.5g·L-1·h-1，具体可为15-35小时，优选为23-31小时。

[0039] 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EC125CGMCC No.5180也属于本发明的保护范围。

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CN 102304553 ACN 102304559 A[0040]

说 明 书

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与现有的补料分批发酵生产L-苏氨酸或L-蛋氨酸的补料过程技术相比，本发明的优点在于：

[0041] (1)将整个发酵过程具体的分为两个阶段控制，根据不同阶段的特点制定相应的补料过程控制方案，便于实现精确控制和优化控制。

[0042] (2)以菌体生长阶段的比生长速率与产物比生产速率关系、非菌体生长阶段的间歇补料量或恒速补料速率与产物生产强度的关系为依据，可实现补料过程的精确的定量优化。

[0043] (3)在菌体生长阶段，比生长速率表征所补加发酵成分在发酵液中的浓度，只需使用分光光度计测量菌体吸光值即可，无需检测该成分浓度，避免繁琐耗时的检测方法，可操作性强，便于生产过程的实时。

[0044] (4)由于培养基中不同的成分对L-苏氨酸或L-蛋氨酸代谢合成的具体影响不同，各组分之间存在交互作用。本发明提供了多种补料成分，可实现多组分补料控制。多组分补料比单一成分补料过程，可进一步提高生产效率。

[0045] 本发明对于L-苏氨酸工业化生产具有非常重要的意义。附图说明

图1为菌体生长阶段异亮氨酸补料的菌体比生长速率与L-苏氨酸比生产速

率的关系。

[0047] 图2为非菌体生长阶段异亮氨酸恒速补料速率与L-苏氨酸生产强度的关系。[0048] 图3为最优异亮氨酸补料过程的L-苏氨酸发酵过程曲线。[0049] 图4为对照处理中的L-苏氨酸发酵过程曲线。

[0050] 图5为磷酸二氢钾与L-异亮氨酸混合补料的L-苏氨酸发酵过程曲线。

[0046]

具体实施方式

[0051] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。L-异亮氨酸：购自sigma，货号58879。[0052] 实施例中采用的发酵罐为7.5L发酵罐(115，NBS)：内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料；也可以通过BioCommand Plus生物过程软件实现指数补料。[0053] LB培养基由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L；氢氧化钠调节pH至7.0。

[00] 微量元素混合液是将溶质溶于水得到的，所述溶质在混合液中的浓度如下：FeSO4·7H2O 10g/L，CaCl21.35g/L，ZnSO4·7H2O 2.25g/L，MnSO4·4H2O 0.5g/L，CuSO4·5H2O 1g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.106g/L，Na2B4O7·10H2O 0.23g/L，CoCl2·6H2O0.48g/L，35％(体积比)HCl水溶液10ml/L。

[0055] 发酵液中L-苏氨酸含量的检测方法：高效液相法，在参考文献(氨基酸和生物资源，2000，22，59-60)中氨基酸检测方法的基础上进行优化，具体方法如下(2，4-二硝基氟苯(FDBN)柱前衍生高效液相法)：

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CN 102304553 ACN 102304559 A[0056]

说 明 书

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取发酵液1mL，8000g离心5min，收集上清液；取10μL上清液于2mL离心管中，加入200μL 0.5M NaHCO3水溶液和100μL 1％(体积比)FDBN乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，加入700μL 0.04mol/L KH2PO4水溶液(pH＝7.2±0.05，用40g/L KOH水溶液调整pH)释并摇匀，放置15min过滤后可进样，进样量为15μL；[0057] 所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent，USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH2PO4水溶液(pH＝7.2±0.05，用40g/100mL KOH水溶液调整pH)，流动相B为55％(体积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1mL/min，洗脱过程如下：

[0058] 洗脱起始时刻(0min)流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为5个阶段，每个阶段中流动相A和流动相D占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为88％、流动相B占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为70％、流动相B占流动相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为30％、流动相B占流动相总流量的体积份数为70％。

以市售L-苏氨酸为标准品(购自sigma，货号17)制作标准曲线，目标峰的保

留时间为14.1min，标准曲线函数为：Y＝0.0009x-0.0623(其中x表示目标峰面积；Y表示L-苏氨酸的浓度，单位为g/L)。[0060] 生产实践中，一般通过诱变或基因敲除获得某种氨基酸缺陷型菌株，以减少目的氨基酸降解或代谢抑制，从而获得目的氨基酸高产株。对于这种氨基酸缺陷型菌株，缺陷型氨基酸的补加必须精确的控制，使细胞生长和产物生产达到最适平衡。本专利的实施例中用于发酵的菌株为大肠埃希氏菌EC125，是一种异亮氨酸缺陷型菌株，异亮氨酸补加过多会提高菌体生长速率，但是抑制L-苏氨酸代谢合成，异亮氨酸补加过少，会菌体生长，降低L-苏氨酸代谢合成速率。因此，发酵液中L-异亮氨酸水平会显著影响L-苏氨酸发酵成产效率。

[0061] 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EC125已于2011年08月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5180。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EC125CGMCC No.5180简称大肠埃希氏菌EC125。[0062] 实施例1、发酵生产L-苏氨酸(异亮氨酸补料)[0063] 一、实验材料

[00] 本实施例所用的种子培养基由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：葡萄糖40g/L，硫酸铵15g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉2g/L，L-异亮氨酸0.05g/L，碳酸钙15g/L，微量元素混合液2mL/L。

[0059]

本实施例所用的发酵初始培养基由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：葡萄糖10g/L，硫酸铵10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉2g/L，微量元素混

[0065]

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合液2mL/L。

[0066] 通过预实验确定以L-异亮氨酸为底物大肠埃希氏菌EC125的细胞得率为107g/g(即每克L-异亮氨酸生成107克干重的大肠埃希氏菌EC125菌体)。[0067] 二、确定菌体生长阶段的最适比生长速率的预实验[0068] 1、菌株的扩大培养(1)将保存在-80℃冻存管的大肠埃希氏菌EC125划线接种于LB培养基平板，置于37℃培养箱中培养12h；

[0070] (2)挑取步骤(1)的单菌落转接入含有3mL液体LB培养基的试管，置于37℃摇床180rpm培养12h；

[0071] (3)取步骤(2)的菌液按3％接种量(体积比)转接入含有30mL种子培养基的500mL摇瓶，置于37℃摇床220rpm培养12h，得到种子液(OD600＝8.5)。[0072] 2、将步骤1的种子液以3％接种量(体积比)接种于发酵罐中的发酵初始培养基，培养至每升发酵液中含有3g菌体(干重)，共得到2.2L发酵液。[0073] 整个步骤2中：通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；通入空气提供溶氧，必要时按1∶1的比例(体积比)通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；补加25％(体积比)氨水pH维持在6.8。[0074] 3、采用补料液甲(L-异亮氨酸的水溶液)进行补料，通过BioCommand Plus生物过程软件控制发酵罐内置的定速可编程控泵，实现指数补料：输入如下程序：F＝(μ·X0·V0·eμt)/(S·Yile/X)，其中F为指数补料速率，μ为设定的比生长速率，X0为初始菌体浓度(数值为3g·L-1)，V0为初始发酵液体积(数值为2.2L)，e为自然对数(数值为2.718)，t为发酵时间，S为补料液甲中的L-异亮氨酸浓度(数值为2g/L)，Yile/X为细胞得率(数值为107g/g)；设置不同的比生长速率组，分别为0.12h-1、0.14h-1、0.16h-1、0.18h-1、0.21h-1。持续进行指数补料和发酵直至菌体生长量不再增加。[0075] 整个步骤3中：通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；通入空气提供溶氧，必要时按1∶1的比例(体积比)通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；补加25％(体积比)氨水pH维持在6.8。

-1

[0076] 检测步骤3的初始时刻和终止时刻每升发酵液中的L-苏氨酸产量(g·L)和菌体干重(g·L-1)。结果见表1。

[0077] 表1步骤3的初始时刻和终止时刻每升发酵液中的L-苏氨酸产量和菌体干重

[0069]

[0078]

[0079] 将初始时刻菌体干重与终止时刻菌体干重的数值相加后再除以2，即为步骤3过

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程中菌体干重的算数平均值。L-苏氨酸的比生产速率(g·g-1·h-1)＝(步骤3终止时刻L-苏氨酸产量-步骤3初始时刻L-苏氨酸产量)÷(步骤3过程中菌体干重的算数平均值×步骤3经历的时间)。在各个比生长速率下，L-苏氨酸的比生产速率见图1。当比生长速率控制在0.16h-1时，比生产速率最高，达到0.30g·g-1·h-1。[0080] 三、确定非菌体生长阶段的最适补料速率的预实验[0081] 1、同步骤二的1。[0082] 2、同步骤二的2。[0083] 3、设置比生长速率为0.16h，其它同步骤二的3。检测步骤3结束时发酵液中的L-苏氨酸产量。持续进行指数补料和发酵直至菌体生长量不再增加(本实施例中为11小时)。

[0084] 4、采用补料液甲(2g/L的L-异亮氨酸的水溶液)进行补料，将发酵罐的补料方式由指数补料方式改为恒速补料方式(设置不同的补料速率组，分别为0mg·L-1·h-1、1.5mg·L-1·h-1、3mg·L-1·h-1或5mg·L-1·h-1，0代表不进行补料，补料速率是以每小时每升发酵液中加入的L-异亮氨酸毫克数计量的)；继续发酵培养至12小时后检测发酵液L-苏氨酸产量。

整个步骤4中：通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；通入空气提供溶氧，

必要时按1∶1的比例(体积比)通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；补加25％(体积比)氨水pH维持在6.8。

[0086] 将步骤4终止时刻L-苏氨酸产量数值减去步骤4初始时刻L-苏氨酸产量数值后除以步骤4的培养时间，得到步骤4的L-苏氨酸的生产速率，见图2。以1.5mg·L-1·h-1的速率恒速补加L-异亮氨酸时，L-苏氨酸的生产速率最高，达到2.14g·L-1·h-1。[0087] 四、发酵生产L-苏氨酸[0088] 1、同步骤二的1。[00] 2、同步骤二的2。[0090] 3、同步骤三的3。[0091] 4、采用补料液乙(2g/L的L-异亮氨酸的水溶液)进行补料，将发酵罐的补料方式由指数补料方式改为恒速补料方式(补料速率为1.5mg·L-1·h-1，补料速率是以每小时每升发酵液中加入的L-异亮氨酸毫克数计量的)；继续发酵培养至L-苏氨酸的生产速率低于0.5g·L-1·h-1(本实施例步骤4进行了31小时)。[0092] 将步骤2的起始时刻作为0，在步骤2、步骤3和步骤4的整个发酵过程中间隔时间取样检测发酵液中的细胞干重和L-苏氨酸含量，结果见图3和表2。计算发酵47h的发酵液中的L-苏氨酸产量，为108.3g·L-1。

[0093] 表2整个发酵过程中的细胞干重和L-苏氨酸含量(部分结果)

[0085] [0094] 发酵时间 6小时 17小时

每升发酵液中的L苏氨酸产量(g·L-1) 6.1 50.3

每升发酵液中的菌体干重(g·L-1)3.124.2

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CN 102304553 ACN 102304559 A 47小时[0095]

108.3

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五、发酵生产L-苏氨酸(步骤四的对照处理)[0096] 1、同步骤二的1。[0097] 2、将步骤1的种子液以3％接种量(体积比)接种于发酵罐中的发酵初始培养基，

培养至每升发酵液中含有3g菌体(干重)。[0098] 3、采用异亮氨酸补料液(即异亮氨酸的水溶液)进行补料，设定发酵罐内置定速可编程控泵，实现恒速补料，补料速率为0.004g·L-1·h-1，持续发酵培养51小时。[0099] 整个步骤2和步骤3中：通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；通入空气提供溶氧，必要时按1∶1的比例通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；补加25％氨水pH维持在6.8。

[0100] 整个发酵过程中间隔时间取样检测发酵液中的细胞干重和L-苏氨酸含量，结果见图4。计算发酵51小时的发酵液中的L-苏氨酸产量，为65.3g·L-1。[0101] 实施例2、发酵生产L-苏氨酸(磷酸二氢钾和异亮氨酸混合补料)[0102] 一、实验材料

[0103] 本实施例所用的种子培养基由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：葡萄糖40g/L，硫酸铵15g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉2g/L，L-异亮氨酸0.05g/L，碳酸钙15g/L，微量元素混合液2mL/L。

[0104] 本实施例所用的发酵初始培养基由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：葡萄糖10g/L，硫酸铵10g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉2g/L，微量元素混合液2mL/L。[0105] 二、发酵生产L-苏氨酸[0106] 1、同实施例1的步骤二的1。[0107] 2、将步骤1的种子液以3％接种量(体积比)接种于发酵罐中的发酵初始培养基，培养至每升发酵液中含有3g菌体(干重)，共得到2.2L发酵液。[0108] 整个步骤2中：通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；通入空气提供溶氧，必要时按1∶1的比例(体积比)通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；补加25％(体积比)氨水pH维持在6.8。[0109] 3、采用补料液甲(即L-异亮氨酸和磷酸二氢钾的水溶液，异亮氨酸的浓度为2g·L-1，磷酸二氢钾的浓度为10g·L-1)进行补料，通过BioCommand Plus生物过程软件控制发酵罐内置定速可编程控泵，实现指数补料：输入如下程序：其中F为指数补料速率，μ为设定的比生长速率(数值为0.16h-1)，X0为初始菌体浓度(数值为3g·L-1)，V0为初始发酵液体积(数值为2.2L)，e为自然对数(数值为2.718)，t为发酵时间，S为L-异亮氨酸补料液浓度(数值为2g/L)，Yile/X为细胞得率(数值为107g/g)。持续进行指数补料和发酵直至菌体生长量不再增加(本实施例中为10.5小时)。[0110] 整个步骤3中：通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；通入空气提供溶氧，必要时按1∶1的比例(体积比)通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；补加25％(体积比)氨水pH维持在6.8。[0111] 4、采用补料液乙(2g/L的L-异亮氨酸的水溶液)进行补料，将发酵罐的补料方式由指数补料方式改为恒速补料方式(补料速率为1.5mg·L-1·h-1，补料速率是以每小时每

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升发酵液中加入的L-异亮氨酸毫克数计量的)；继续发酵培养至L-苏氨酸的生产速率低于0.5g·L-1·h-1(本实施例的步骤4进行了23小时)。[0112] 将步骤2的起始时刻作为0，在步骤2、步骤3和步骤4的整个发酵过程中间隔时间取样检测发酵液中的细胞干重和L-苏氨酸含量，结果见图5和表3。计算发酵41h的发酵液中的L-苏氨酸产量，为108.8g·L-1。生产强度比仅利用L-异亮氨酸单组份补料提高了15.2％。多组分补料比单一成分补料过程，可进一步提高生产效率。[0113] 表3整个发酵过程中的细胞干重和L-苏氨酸含量(部分结果)

[0114] 发酵时间 7.5小时 18小时 41小时

每升发酵液中的L苏氨酸产量(g·L-1) 7.0 52.4 108.8

每升发酵液中的菌体干重(g·L-1)3.324.223.5

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图1

图2

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图3

图4

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