南京中医药大学学报2007年3月第23卷第2期
JOURNALOFNANJINGTCMUNIVERSITYVol.23No.2Mar.2007
连花清瘟胶囊对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响
郭海,张庆宏,杨进3,龚婕宁,赵岩松,周晓平 (南京中医药大学基础医学院,江苏南京 210046)
摘要:目的 观察连花清瘟胶囊对流感病毒感染小鼠T淋巴细胞亚群和小鼠肺组织γ2IFN的影响。方法 ICR小鼠滴鼻建立感染模型。用流式细胞法测定小鼠血T淋巴细胞亚群的变化,采用双抗体夹心ABCELISA法检测肺组织γ2IFN。结果 ①连花清瘟胶囊大剂量对小鼠感染流感病毒FM1后血中CD4+和CD4+/CD8+明显下降有一定的抑制作用,与模型
组比较有显著差异(P<0.05)。②连花清温胶囊高、中、低3个剂量均能明显升高小鼠肺匀浆中的γ2IFN含量,与模型组比较差异显著(P<0.05,0.01)。结论 ①连花清瘟胶囊对流感病毒感染引起的细胞免疫功能降低有一定的抑制作用。②连花清瘟胶囊能提高流感病毒感染小鼠肺中γ2IFN的水平。关键词:连花清瘟胶囊;流感病毒FM1;T淋巴细胞亚群γ;2干扰素
中图号:R282.710.5 文献标识码:A 文章编号:100025005(2007)02-0106-03
呼吸道病毒感染性疾病因感受温邪而发病,分别散见于温病的风温、春温、冬温。临床症状表现与机体免疫功能的失调和降低密切相关。中药治疗不仅强调选用清热透散之品迅速祛除病邪,还通过扶助正气以祛邪外出。连花清瘟胶囊主要有连翘、金银花、炙麻黄,绵马贯众、板蓝根、石膏、鱼腥草、炒苦杏仁、甘草、广藿香、红景天等中药组成。现代药理研究表明,炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、甘草具有镇咳祛痰、解热平喘、抗炎抗过敏、增强免疫功能等作用。板蓝根、鱼腥草具有提高机体免疫、抑制病毒的作用。对于呼吸道病毒感染引起的表里同病,热势亢盛的病理变化有显著治疗作用,充分体现了中医扶正祛邪的特点,具有整体治疗的优势。本实验探讨了连花清瘟胶囊对流感病毒FM1感染小鼠T淋巴细胞亚群和肺组织γ2IFN的影响,现将研究结果发表于此。1 实验材料1.1 动物
清洁级ICR小鼠,雌雄各半,18～22g,由南京医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许
可证号:SCXK(苏)200220031,实验动物使用许可
证号SYXK(苏)200220053。1.2 药物与试剂
连花清瘟胶囊浸膏(石家庄以岭药业股份有限公司提供);利巴韦林(江西汇仁药业有限公司生产,批号:0503008);乙醚(南京第一化学试剂厂生产,批号:041001);MouseAntiRatCD3:Fitc,MouseAntiRatCD4:Rpe,MouseAntiRatCD8:Rpe2Cy5(英国Sertec公司生产,深圳晶美生物工程有限公司提供);γ2IFN测定试剂盒(南京建成生物试剂有限公司提供)。1.3 病毒毒种
流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1,南京中医药大学温病研究所保存,血凝效价1∶1024,LD50为1024.86。1.4 主要仪器
流式细胞仪(美国BECTONDICKINSON公司制造,型号FACSCalibur),电子天平、微量移液器、HH24数显恒温水浴锅、酶标仪、高速离心机、高速匀浆机。
收稿日期:2006-10-29;修稿日期:2006-11-21基金项目:河北以岭集团横向课题
作者简介:郭海(1971-),男,河北张家口人,南京中医药大学2004级博士研究生。3通讯作者:025-85811533
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郭海,等:连花清瘟胶囊对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响 第2期—107—
2 方法与结果2.1 实验方法
2.1.1 小鼠T淋巴细胞亚群实验2.1.1.1 动物分组
将小鼠随机分成5组,分别为正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、连花清瘟大、小剂量组。2.1.1.2 造模方法
各组小鼠在乙醚麻醉下,从鼻腔滴入15倍LD50量的病毒液50μL/只。正常对照组同法滴入无菌生理盐水,并移至另室饲养。
2.1.1.3 给药方法
各组小鼠分别灌胃给药,每日1次。连花清瘟大剂量为0.39g/kg(成人等效剂量)、小剂量为0.13g/kg、利巴韦林剂量为0.0585g/kg,正常对照组、模型对照组给等容积生理盐水。给药3d感染小鼠,感染后连续给药5d。2.1.1.4 T淋巴细胞亚群测定
末次给药24h后,摘眼球采血,以肝素抗凝。取全血样本50μL,分别加入CD3+、CD4+、CD8+抗体各10μL,室温下静置反应15min。然后加入溶血素500μL,充分混匀,室温静置反应2min后以1000r/min离心5min,弃除上清液。沉淀加生理盐水2mL,洗涤,1000r/min,离心5min。沉淀再加生理盐水0.4mL,混匀,上流式细胞仪检测,用CELLQuest软件分析。2.1.2 小鼠肺组织γ2IFN实验2.1.2.1 动物分组
将小鼠随机分成6组,分别为正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、连花清瘟高、中、低剂量组。
2.1.2.2 造模方法
各组小鼠在乙醚麻醉下,从鼻腔滴入15倍LD50量的病毒液50μL/只。正常对照组同法滴入
组别正常组模型组病毒唑组连花清瘟大剂量组连花清瘟小剂量组
n78877
CD3+12.54±4.9212.91±5.1812.43±3.4311.34±2.9211.76±1.63
无菌生理盐水,并移至另室饲养。2.1.2.3 给药方法
各组小鼠分别灌胃给药,每日1次。连花清
瘟高剂量为1.17g/kg、中剂量为0.39g/kg(成人等效剂量)、低剂量为0.13g/kg、利巴韦林剂量为0.0585g/kg,正常对照组、模型组给等容积生理盐水。给药3d感染小鼠,感染后连续给药5d。2.1.2.4 肺组织γ2IFN测定
末次给药24h后,摘眼球放血处死小鼠,取小鼠肺,在低温条件下,按常规方法制作肺组织匀浆,[肺质量(g)/生理盐水(ml)=1/9],4℃2500r/min离心30min后取上清,放入-20℃冰箱中保存待测。
检测方法:采用双抗体夹心ABCELISA法。检测程序按照试剂盒说明书进行。结果计算时所有A值都应减除空白值后再行计算。以标准品2000,1000,500,250,125,62,31,16,0pg/mL之A值用Excel软件做散点图,并求出对数公式。根据样品A值,求出该细胞因子的含量。2.1.3 统计方法
采用SPSS统计分析软件进行统计学处理。2.2 实验结果2.2.1 连花清瘟胶囊对流感病毒感染小鼠T淋巴细胞亚群的影响
结果表明,小鼠感染流感病毒FM1后血中的CD4+和CD4+/CD8+明显下降,而连花清瘟胶囊大剂量对此有一定的抑制作用,与模型组比较有显著差异(P<0.05)。见表1。
2.2.2 连花清瘟胶囊对肺组织γ2IFN含量的影响
实验结果显示,连花清瘟胶囊高、中、低3个剂量均能明显升高小鼠肺匀浆中的γ2IFN含量,与模型组比较差异显著。见表2。
CD4+
15.93±8.9038.37±3.0810.52±3.8410.74±2.7139.81±3.30
CD8+9.87±6.838.36±2.476.87±2.886.16±1.786.39±2.46
CD4+/CD8+1.95±0.3931.14±0.701.71±0.711.80±0.4131.50±0.61
表1 连花清瘟胶囊对流感病毒感染小鼠T淋巴细胞亚群的影响(�x±s)
注:与模型组比较,3P<0.05。
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南京中医药大学学报2007年3月第23卷第2期表2 连花清瘟胶囊对肺组织γ2IFN含量的影响(�x±s)
组别正常对照组
模型组利巴韦林组连花清瘟高剂量组连花清瘟中剂量组连花清瘟低剂量组
n656777
调节作用,在病毒性疾病的康复中具有重要的地位。
实验表明连花清瘟胶囊对流感病毒感染引起的细胞免疫功能降低有一定的抑制作用,并能够提高小鼠流感病毒后肺组织中的γ2IFN水平。因而提示该药抗流感病毒的作用,可能是通过调整T细胞亚群的百分率或及其比值实现的,也可能是通过提高肺中γ2IFN水平来调节机体免疫功能,从而增强CTL、NK杀伤活性及单核巨噬细胞抗病毒能力实现的。
参考文献:
[1]刘涛,陆平成,许冬青,等.清热养阴方药及其配伍对
γ2IFN/pg·mL-1
77.67±26.8933358.2±144.42
108.17±105.093812.5±349.343807.5±160.653837.5±265.863
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注:与模型组比较,3P<0.05,33P<0.01。
3 讨论
呼吸道流感病毒感染性属于中医“时行感冒”和“风温”的范畴,主要侵犯气管、支气管、细支气
管和肺泡表面的上皮细胞。T淋巴细胞是机体免疫系统实现细胞免疫和免疫调节作用的主要成分,外周血T淋巴细胞亚群测定可良好的反应机体细胞免疫状态。CD3+、CD4+及CD8+T细胞亚群的百分率或CD4/CD8比值是评估机体免疫状态的可靠指标。γ2IFN主要由活化的Th1细胞和NK细胞产生,是机体抗病毒感染中最重要的细胞因子之一。它不仅可以阻止病毒在体内复制和扩散,而且能对许多免疫细胞发挥强大的免疫
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感病毒FM1感染小鼠肺中γ2IFN、TNF2α,IL210及IL26蛋白动态表达的影响[J].中国中药杂志,2005,30(7):541.
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感染乳鼠血清γ2IFN、TNF2α的影响[J].中国中医药信息杂志,2005,12(3):36.
(编辑:李伟东)
EffectofLianhuaQingwenCapsuleonImmunityofMiceInfectedwithFluVirus
GUOHai1,ZHANGQing2hong1,YANGJin2,GONGJie2ning2,ZHAOYan2song1,ZHOUXiao2ping1(BasicMedicalCollegeofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu,210029,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE ToobservetheeffectofLianhuaQingwenCapsuleonT2lymphocytesubgroupandlungtissueγ2IFNofmiceinfectedwithfluvirus.METHOD ICRnasaldropwasgiventoestablishinfectionmodels,flowcytometrywasusedtoexaminethe
γchangesinthemiceT2lymphocytesubgroupanddicaryonsandwichmethodwithABCELISAwasusedtoexaminethelungtissue2IFN.
+RESULT ①LargedosagesofLianhuaQingwenCapsulehadinhibitingeffectonthemarkeddecreaseofCDandCD4+/CD8+in4
miceafterinfectedwiththefluvirusFM1,withmarkeddifferencesascomparedwiththecontrolgroup(P<0.05).②Large,medium
γandlowdosagesofLianhuaQingwenCapsulecouldmarkedlyincreasethecontentsof2IFNinmicelunghomogenate,withmarkeddiffer2
encesascomparedwiththecontrolgroup(P<0.05,0.01).CONCLUSION ①LianhuaQingwenCapsulehasinhibitingeffectonde2creaseofcellimmunitycausedbyinfectionoffluvirus.②LianhuaQingwenCapsulecanincreasethelevelofγ2IFNinmicelungsinfect2edwithfluvirus.
KEYWORDS:LianhuaQingwenCapsule;fluvirusFM1;T2lymphocytesubgroup;γ2IFN
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