水中大肠菌群的测定

水中大肠菌群的测定

水中大肠菌群的测定

一 、实验目的

1、了解和学习大肠菌群落的测定原理和测定意义

2、学习和掌握大肠菌群数量与饮水卫生质量的关系和检测方法二、实验原理

大肠菌群是一群能在37℃培养、48h内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧格兰

氏染色阴性无芽孢杆菌。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群等多种些

细菌，这

细菌都可以随人畜排泄物进入水源。一些水中的肠道病原菌如沙门氏菌，也存

在于人的粪便中，它们的致病能力强，存活能力差，数量有限，而且培养的条件苛刻，分离和鉴别比较困难，样品监测即使为阴性，也不能保证没有病原微生物的存在。而大肠菌群存活能力强，数量庞大，检测方法比较简易。此外，大肠菌群细菌在水中的存活时间、对消毒剂和水体中不良因素的抵抗力与病原菌相似，可以作为人畜粪便污染的指示菌。

目前，国际上已经公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群落的检查。《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）规定：生活饮用水总大肠菌群数规定为MPN/100mL或CFU/100mL不得检出。MPN 为最大可能适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。MPN是水的标准分析法，适用于各种水样，包括初发酵、平板分离和复发酵三部分。

三、实验材料1、水样：400mL

2、培养基：乳糖蛋白胨半固体培养基、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液、EMB培养基。3、灭菌水：作阴性对照用。

4、接种大肠埃希菌的水样：做阳性对照用。

5、试剂和染色剂：草酸铵结晶紫染液，碘液，泛红染液，脱色液。 6、仪器设备：超净工作台，恒温培养箱，显微镜等。

7、其他：无菌移液管、无菌锥形瓶、发酵用试管、杜氏小管、培养皿、移液枪、酒精灯等。

四、操作步骤1、初发酵

在3倍浓缩乳糖培养基中加入稀释度为10^-1、10^-2、10^-3的被检样品10mL，每个稀释度5个重复，混合均匀置于37℃培养24h。2、平板分离

培养24h后如果不产酸(乳糖发酵液变黄色)，产气（小指管底部有气泡）和不变浑浊者为阴性反应，产酸、产气或者仅产酸的乳糖发酵管为阳性反应，将阳性反应划线接种在伊红美兰平板上并且进行划线接种，37℃培养24h。

菌落的特征类型为：

在伊红美兰平板上大肠菌群的典型菌落为深紫黑色，具有金属光泽；或者紫黑色，不带或略带金属光泽；或者淡紫红色，中心较深的群落。将带有上述典型特征的菌落做革兰氏染色镜检，观察革兰氏染色反应结果和观察有无芽孢。3、复发酵

将上述革兰氏染色镜检为阴性无芽孢杆菌的菌落接种到乳糖蛋白胨半固体培养基中，37℃培养24h。如仍然为产酸、产气者则为大肠菌群阳性，即证明有大肠菌群存在。证实后，再根据发酵实验的阳性管数查表，得出每升水样中大肠杆菌群数。

五、注意事项

1、配置不同种类型的培养基时要准确。2、检测中应该合理控制所加的水量。3、多管发酵法中水样稀释比例要适宜。

4、挑选菌落时认真选择大肠菌群典型菌落。

六、数据处理

10mL管2个显阳性，1mL管0个显阳性，0.1mL管1个显阳性，100mL水样中MPN为7，在95%的置信区间内出现的大肠菌群数的范围为[1,17]。实验水样的体积为400mL,则水样中的大肠菌群MPN为28.

MNP并非水中大肠菌群的绝对浓度，而是浓度的统计值。下限表示在95%的概率下每100mL水样中大肠菌群数量的最少是1，上限表示在95%的概率下每100mL水样中大肠菌群数量的最多为17。