微生物实验报告

一、实验目的

1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。 2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。 二、实验原理

水携带的病原菌的存在与肠道来源的细菌相关，肠道病原微生物进入水体，随水流传播可引起肠道病爆发流行，所以必须对水中病原微生物严格监控。但要从水体中直接检出病原微生物比较困难，它们在水中的数量很少且培养条件苛刻，分离和鉴别都比较难，即使样品检测结果是阴性也不能保证没有病原微生物的存在。因此，常用指示微生物作为水体中病原微生物的监测指标。大肠菌群细菌在人的肠道和粪便中数量很多，受到粪便污染的水容易被检出，且检测方法比较简易。所以，常以大肠菌群为微生物评价水的卫生质量。大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~48h能发酵乳糖产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia)、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）。大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值，根据水中大肠菌群的数目即可判断水源是否被粪便污染，并推断水源受肠道病原菌污染的可能性。本实验主要通过多管发酵法检测水中大肠菌群的数量。 多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖胆盐发酵液体培养基，并倒置一杜拉姆发酵小管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。 1.初发酵试验

水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。 2.平板分离

初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在伊红美蓝琼脂（EMB）培养基平板上划线分离菌落。

3.复发酵试验（本实验只要求做到镜检） 以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。 三、实验材料

1、培养基及试剂：

乳糖胆盐发酵培养基，三倍浓缩乳糖胆盐发酵培养基，伊红美蓝琼脂培养基，灭菌水，革兰氏染液等。

2、仪器或其他用具：

载玻片，盖玻片，锥形瓶（1个），灭菌吸管（1支），灭菌试管(20支)，平皿（12个），无菌枪，试管架，酒精灯，接种针，棉塞等。 四、实验步骤 1.水样采取：

本实验水样来自辽宁科技大学花坛和人工湖。取距水面10~15cm的深层水样，先将瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。

2.培养基的制备：

本实验使用的培养基是商品培养基。准确配制出120ml的乳糖胆盐发酵液体培养基，10ml的三倍浓缩乳糖胆盐发酵液体培养基，150ml的伊红美蓝琼脂培养基。 3.灭菌消毒：

取出18支干净的试管，每个试管中倒置一个杜拉姆发酵小管，均加入5ml的乳糖胆盐发酵

液体培养基。另取2支试管，倒置杜拉姆发酵小管，各加入5ml的乳糖胆盐发酵液体培养基。将上述的试管，平皿，EMB培养基等实验器具，放入高压蒸汽灭菌锅中，在121℃下，灭菌30min。 4. 初发酵试验

在两个装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖胆盐发酵培养液的大试管（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样10mL。在18支装有已灭菌的5mL乳糖胆盐液体培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的2种水样的各种稀释梯度1mL，混匀后置于37℃恒温箱内培养48h。 5.平板分离：

上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落：伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。 6．革兰氏染色镜检：

取上述特征的群落进行革兰氏染色：

（1）取上述特征的培养物涂片，涂层要薄； （2）将涂片在火焰上加温固定（不宜过热）

（3）待冷却后滴加结晶紫溶液进行初染，1min后用水洗去；

（4）用碘液冲去残水，并用碘液覆盖进行媒染，1min后用水洗去；

（5）用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直止无紫色脱落为止（约20～30s），用水洗去；

(6)滴加番红复染2~3min，水洗，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。

7.证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。

五、思考题

（1） 何谓大肠菌群，它主要包括哪些细菌属？

（2） 为什么EMB培养基的琼脂平板能够作为检测大肠菌群的鉴别平 （3）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？