微生物检测

实验菌种：试验用菌均购自。。。。。。 大肠杆菌（Escherichia coli）（）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（） 枯草杆菌（Bacillus subtilis）（） 白色念珠菌（Candida a lbicans）（） 黑曲霉菌（Aspergillus niger）（）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（） 培养基及稀释液: 氯化钠 蛋白胨 仪器和试剂：

指标 实验方法：

实验方法均按美国药典的方法，菌种要求不得超过5代，菌液制备为不超过100cfu/mL。 1、培养基的加速增长 1.1细菌菌液的制备：

取经30～35℃培养18～24h后的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌株营养琼脂斜面，分别加入10mL无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（PH7.0），制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的悬液。取菌悬液1mL，加9ml无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（PH7.0），（依次作此制备10倍系列稀释液至10～6～10～810倍稀释至10～6～10～8。）分别取上述四种菌10～6～10～8稀释菌液各1mL ，加入无菌培养皿，分别注入大豆-酪蛋白胰酶消化物琼脂15mL～20mL，每级稀释度做2皿30～35℃培养24小时后，计数，以确定菌悬液浓度约为50～100cfu/mL时的稀释度。

取20～25℃培养2～3d后的白色念珠菌沙保罗氏葡萄糖琼脂斜面，加入10mL的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（PH7.0），制得白色念珠菌菌悬液，取菌悬液1mL，加9mL无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（PH7.0），依次作10倍稀释至10～6～10～8。分别取各级稀释度的菌液1mL，加入无菌培养皿中，注入沙保罗氏葡萄糖琼脂15mL～20mL，每级稀释度做2皿。20～25℃培养2～3d后，计数，以确定菌悬液浓度50～100cfu/mL时的稀释度。

取20～25℃培养5～7d后的黑曲菌沙保罗氏葡萄糖琼脂斜面，加入10mL的无菌含0.05%吐温80的氯化钠-蛋白胨缓冲液（PH7.0），制得白色念珠菌菌悬液，取菌悬液1mL，加9mL无菌含0.05%吐温80的氯化钠-蛋白胨缓冲液

（PH7.0），依次作10倍稀释至106～108。分别取各级稀释度的菌液1mL，

～

～

加入无菌培养皿中，注入沙保罗氏葡萄糖琼脂15mL～20mL，每级稀释度做2皿。20～25℃培养5～7d后，计数，以确定菌悬液浓度50～100cfu/mL时的稀释度。

表1 菌液各级稀释度计数 细菌名称 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 黑曲霉

1.2培养基的促生长实验

1.2.1将少量菌种（50～100cfu）接种到如下相对应的培养基并在相应的条件下培养。 微生物菌株 试验菌株制培养基促进生长试验 备 试验试样菌落数

采用的稀释度

好氧微生物酵母菌和霉好氧微生物酵母菌和霉总数 菌总数 总数 菌总数 金黄色葡萄球大豆－酪蛋大豆－酪蛋 菌 ATCC 6538 白胰酶消化白胰酶消化物琼脂 或大物琼脂和大豆－酪蛋白豆－酪蛋白大豆－酪蛋 白胰酶消化物琼脂/MPN法大胰酶消化物胰酶消化物肉汤 30-35℃ 18-24h 肉汤 100cfu 30-35℃,3天 豆－酪蛋白胰酶消化物肉汤 100cfu 30-35℃, 3天 铜绿假单胞菌 ATCC 9027 大豆－酪蛋大豆－酪蛋 白胰酶消化白胰酶消化物琼脂 或大物琼脂和大豆－酪蛋白豆－酪蛋白胰酶消化物胰酶消化物肉汤 30-35℃ 18-24h 肉汤 100cfu 30-35℃,3天 大豆－酪蛋 白胰酶消化物琼脂/MPN法大豆－酪蛋白胰酶消化物肉汤 100cfu 30-35℃, 3天 枯草芽孢杆菌 ATCC 6633 大豆－酪蛋大豆－酪蛋 白胰酶消化白胰酶消化物琼脂 或大物琼脂和大豆－酪蛋白豆－酪蛋白胰酶消化物胰酶消化物营养肉汤 营养肉汤 大豆－酪蛋 白胰酶消化物琼脂/MPN法大豆－酪蛋白胰酶消化物30-35℃ 18-24h 100cfu 30-35℃,3天 营养肉汤 100cfu 30-35℃, 3天 白色念珠菌 ATCC 10231 沙保罗氏葡大豆－酪蛋沙保罗氏葡大豆－酪蛋沙保罗氏葡萄糖琼脂或白胰酶消化萄糖琼脂 沙保罗氏葡物萄糖营养汤 琼脂100cfu 白胰酶消化萄糖琼脂 物琼脂20-25℃，5天 100cfu 20-25℃，5100cfu 天 30-35℃,5天 20-25℃，30-35℃,52-3天 黑曲霉 ATCC 16404 天 沙保罗氏葡大豆－酪蛋沙保罗氏葡大豆－酪蛋沙保罗氏葡萄糖琼脂或白胰酶消化萄糖琼脂 土豆－葡萄物糖琼脂 琼脂100cfu 白胰酶消化萄糖琼脂 物琼脂20-25℃，5天 100cfu 20-25℃，5100cfu 天 30-35℃,5天 20-2℃5，30-35℃,55-7天 1.2.3结果

天 培养基上长出的菌落数与已知菌量（标准接种体的菌落数）的差异一定不能大于2倍系数。则证明培养基是合格的。 1.2.4供试液的制备：

3.1用70%乙醇消毒取样口，无菌操作取供试品10g，置于无菌锥形瓶中，缓慢加入预热至30度左右的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至总体积100mL，边加

边振摇使混匀，即为1：10供试液，取1：10供试液10mL，加90mL无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（PH7.0），（依次10倍稀释至10～2～10～3）

1.3微生物的回收率

1.3.1实验组：

1.3.1.1细菌组计数：分别取不同稀释度的供试液10mL，过滤（用不大于0.45 µm

的标准孔径薄膜），再用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为冲洗液冲洗滤膜，每次

50mL，冲洗量100mL。做两个平行，转移薄膜到大豆－酪蛋白胰酶消化物琼脂上，30～35℃培养3～5d，观察结果，计数。

1.3.1.2霉菌、酵母菌组计数：分别取不同稀释度的供试液10mL，过滤（用不

大于0.45 µm的标准孔径薄膜），再用无菌含0.05%吐温80氯化钠-蛋白胨缓冲

液作为冲洗液冲洗滤膜，每次50mL，冲洗量100mL。做两个平行，转移到沙

保罗氏葡萄糖琼脂上培养5～7d，，观察结果，计数。

阳性对照组：分别取50～100cfu/mL的枯草杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌，铜绿假单胞杆菌悬液1mL，分别加入无菌培养皿中，注入大豆－酪蛋白胰00000酶消化物琼脂培养基约15～20mL，30～35℃培养3～5天，观察结果，计数：分别取50～100cfu/mL的白色念珠菌菌液及黑曲霉孢子悬液1mL，加入无菌培养皿中。每种菌液做2个平行，注入沙保罗氏葡萄糖琼脂培养基约15mL～20mL，20～25℃培养5～7d，观察结果，计数。 1.3.2阴性对照组：

1.3.2.1细菌阴性对照组：取1mL氯化钠-蛋白胨缓冲液加入无菌培养皿中，注入大豆-酪蛋白胰酶消化物琼脂培养基约15～20mL，30～35度培养3～5d，观察结果，计数。

1.3.2.2酵母菌、霉菌阴性对照组：取1mL含0.05%吐温80氯化钠-蛋白胨缓冲液加入无菌培养皿中，注入沙保罗氏葡萄糖琼脂培养基约15mL～20mL，20～25℃培养5～7d，观察结果，计数。

2、控制菌检查：

2.1试样用菌的制备

2.1.1接种胆汁耐受革兰氏阴性菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌至大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤或琼脂培养基中，30～35℃培养18～28小时。取经30～35℃培养18～28h后的胆汁耐受革兰氏阴性菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌沙门氏菌菌株营养琼脂斜面分别加入10mL无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（PH7.0），制备胆汁耐受革兰氏阴性菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的悬液。取菌悬液1mL，加9m无菌l氯化钠蛋白胨缓冲液（PH7.0），（依次10倍稀释至10～6～10～8。分别取上述五种菌10～6～10～8稀释菌液各1mL ，加入无菌培养皿，分别注入大豆-酪蛋白胰酶消化物琼脂15mL～20mL，每种稀释度做2皿30～35℃培养24小时后，计数，以确定菌悬液浓度约为50～100cfu/mL时的稀释度。

2.2培养基促生长与抑制生长实验： 2.2.1大肠杆菌实验：

2.2.1.1取大肠杆菌菌液1mL（50～100cfu/mL），加入无菌培养皿中，注入麦氏肉汤培养基琼脂培养基15～20mL，30～35度培养18小时，观察结果。

2.2.1.2取金黄色葡萄球菌菌液1mL（小于100 cfu/mL），加入无菌培养皿中，注入麦氏肉汤培养基琼脂15～20mL，30～35度培养18小时，观察结果。

2.2.2沙门氏菌实验：

2.2.3.1分别取沙门氏菌菌液1mL（50～100cfu/mL），加入无菌培养皿中，注入沙门氏菌显色培养肉汤、XLD琼脂培养基15～20mL，30～35度培养18小时，观察结果。

2.2.3.2取金黄色葡萄球菌菌液1mL（50～100cfu/mL），加入无菌培养皿中，注入沙门氏菌显色培养肉汤15～20mL，30～35度培养24小时，观察结果。

2.2.3铜绿假单胞菌实验：

2.2.3.1取铜绿假单胞菌菌液1mL（50～100cfu/mL），加入无菌培养皿中，注入溴棕三甲胺琼脂培养基15～20mL，30～35度培养18小时，观察结果。

2.2.3.2取大肠杆菌菌液1mL（50～100cfu/mL），加入无菌培养皿中，注入溴棕三甲胺琼脂培养基15～20mL，30～35度培养24小时，观察结果。

2.2.4金黄色葡萄球菌实验

2.2.4.1取金黄色葡萄球菌菌液1mL（50～100cfu/mL），加入无菌培养皿中，注入甘露醇琼脂培养基15～20mL，30～35度培养18小时，观察结果。

2.2.4.2取大肠杆菌菌液1 mL（50～100cfu/mL），加入无菌培养皿中，注入甘露醇琼脂培养基15～20mL，30～35度培养24小时，观察结果。 2.3方法实用性：

2.3.1取供试品1g用大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤稀释制备10mL试样液，混匀并在30～35℃培养18～24小时，振荡培养液，取1mL培养液及1mL大肠杆菌菌液（50～100cfu/mL）至100mL麦氏肉汤培养基中在42～44℃培

养24～48小时，观察结果。

2.3.2取供试品1g，用大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤稀释制备10mL试样液，混

匀并在30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，取0.1mL培养液及1mL沙

门氏菌菌液（50～100cfu/mL）至10mL沙门显色培养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时，再转接到 XLD营养琼脂培养基上，在30～35℃培养18~48小时，观察结果。

2.3.3取供试品1g用大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤稀释制备10mL试样液，混匀并

在30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，分别取1mL培养液及1mL铜绿

假单胞菌菌液（50～100cfu/mL）再转接到100mL溴棕三甲铵培养基中，在30～35℃培养18~72小时，观察结果。

2.3.4取供试品1g用大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤稀释制备10mL试样液，混匀并

在30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，分别取1mL培养液及1mL金黄

色葡萄球菌菌液（50～100cfu/mL）加入无菌培养皿，注入15～20mL甘露醇琼脂培养基，30～35℃培养18~72小时，观察结果。

2.4产品实验：

2.4.1产品中大肠杆菌的检测：

2.4.1.1取供试品1g，用大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤稀释制备10mL试样液，混匀并在30～35℃培养18～24小时，振荡培养液取1mL至100mL麦氏肉汤培养基中并在42～44℃培养24～48小时，观察结果。

2.4.1.2阳性对照试验：取50～100cfu/mL的大肠杆菌菌液1mL，接种于

100mL大豆-酪蛋白肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，震荡以上培养液，移1mL大豆-酪蛋白培养液至麦氏肉汤中，42～44℃培养24～48小时，

观察结果。

2.4.1.3阴性对照试验：取1mL大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤，加入100mL大豆-酪蛋白肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，震荡以上培养液，移1mL大豆-酪蛋白培养液至麦氏肉汤中，42～44℃培养24～48小时，观察结果。

2.4.1.4结果分析：阳性对照如有相应的菌落生长，阴性对照没有菌落存在的情况下，供试液也没有菌落存在，产品符合要求。

2.4.2沙门氏菌

2.4.2.1产品中沙门氏菌的检测：取供试品1g，用大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤稀

释制备10mL试样液，混匀并在30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，取0.1mL

大豆-酪蛋白消化物肉汤培液至10mL沙门显色培养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时，再转接到 XLD营养琼脂培养基上，在30～35℃培养18~48小时。

2.4.2.2阳性对照：取50～100cfu/mL的沙门杆菌菌液1mL，接种于100mL大豆-酪蛋白肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，取0.1mL大豆-酪蛋白培养液至10mL沙门显色培养肉汤中，30～35℃培养18～24小时，再转接到 XLD营养琼脂培养基上，在30～35℃培养18~48小时。

2.4.2.3性对照：同2.4.2阳性对照，只是将取小于100 cfu/mL的沙门杆菌菌液1mL换成1mL大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤

2.4.4.4结果分析：

阳性对照如有相应的菌落生长，阴性对照没有菌落存在的情况下，供试液没

有生长良好的，红色的，含有或不含有黑心菌落，产品符合要求。

2.4.3、铜绿假单胞菌

2.4.3.1产品中铜绿假单胞菌：取供试品1g用大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤稀释

制备10mL试样液，混匀并在30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，再转接到

溴棕三甲铵培养基中，在30～35℃培养18~72小时。

2.4.3.2阳性对照：取50～100cfu/mL的铜绿假单胞菌菌液1mL，接种于10mL大豆-酪蛋白肉汤培养基中，混匀并在30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，再转接到100mL溴棕三甲铵培养基中，在30～35℃培养18~72小时。

2.4.3.3阴性对照：同2.4.3.2阳性对照，只是将取小于100 cfu/mL的铜绿假单胞菌菌液1mL换成1mL大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤

2.4.3.4结果分析：阳性对照如有相应的菌落生长，阴性对照没有菌落存在的情况下，供试液有菌落生长则显示可能有铜绿假单胞菌，产品复合要求。 2.4.4金黄色葡萄球菌

2.4.4.1产品中金黄色葡萄球菌的检测：取供试品1g用大豆-酪蛋白胰酶消化

物肉汤稀释制备10mL试样液，混匀并在30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，

再转接到甘露醇盐琼脂培养基中，在30～35℃培养18~72小时。

2.4.4.2阳性对照：取50～100cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液1mL ，接种于10mL大豆酪蛋白肉汤培养基中，摇匀并在30～35℃培养18～24小时，混匀培养液，再转接到甘露醇盐琼脂培养基中，在30～35℃培养18~72小时。

2.4.4.3阴性对照：同2.4.4.2阳性对照，只是将取小于100 cfu/mL的铜绿假单胞菌菌液1mL换成1mL大豆-酪蛋白胰酶消化物肉汤

2.4.4.结果分析：阳性对照如有相应的菌落生长，阴性对照没有菌落存在的情况下，供试液没有菌落，产品符合要求。

控制菌检查法结果：

细菌名称 大肠杆菌 沙门氏菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌

供试品组

阳性对照组

阴性对照组