一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112301160 A(43)申请公布日 2021.02.02

(21)申请号 202010831484.X(22)申请日 2020.08.18

(71)申请人 上海纳米技术及应用国家工程研究

中心有限公司

地址 201109 上海市闵行区剑川路468号(72)发明人 崔大祥　李雪玲　田静　徐艳　

陈晓敏　刘泽熙　梁辉　(74)专利代理机构 上海东亚专利商标代理有限

公司 31208

代理人 董梅(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图3页

(54)发明名称

一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒(57)摘要

本发明公开了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒含有酶反应体系，通过在酶反应体系下进行扩增反应，用于确定待测样品中是否存在新型冠状病毒的核酸。本发明检测试剂盒具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高等优点，只需采用简单的控温装置即可以实施，非常适于广泛应用检测部门推广使用，可以加快疑似病例患者和密切接触人群检测速度，同时最大限度地避免当前由检测灵敏度低引致的漏检问题。

CN 112301160 ACN 112301160 A

权　利　要　求　书

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1.一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒核酸检测试剂盒含有酶反应体系，通过在酶反应体系下进行扩增反应，确定待测样品中是否存在新型冠状病毒的核酸；

所述的酶反应体系中至少包括扩增引物中的第一引物组、第二引物组或者第三引物组中的一组；

所述的第一引物组含有上游外引物F3：5’-TGGCTACTACCGAAGAGCT-3’ (SEQ ID NO：1)和S下游外引物B3：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGAT-3’ (SEQ ID NO：2)；

所述的第二引物组含有上游内引物FIP：5’-TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG-3’ (SEQ ID NO：3)和下游内引物BIP：5’-AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT-3’(SEQ ID NO：4)；

所述的第三引物组含有上游环引物LF：5’-GGACTGAGATCTTTCATTTTACCGT-3’(SEQ ID NO：5)和上游环引物LF：5’- ACTGAGGGAGCCTTGAATACA -3’ (SEQ ID NO：6)。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的酶反应体系还包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg2+、甜菜碱、dNTP、Bst DNA聚合酶中的一种或者几种。

3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的酶反应体系还包括逆转录酶。

4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的新型冠状病毒核酸的检测试剂盒还含有显色剂；

所述的显色剂选自：Sybr Green I、Genefinder或GelRed。

5.根据权利要求1-4中任意一种所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒含有：

1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，6 mmol/L Mg2+，0.6 mol/L的甜菜碱、1.2 mmol/L dNTP，浓度分别为0.2 μmol/L的F3和B3引物，浓度分别为1.6 μmol/L的FIP和BIP引物，浓度分别为0.4 μmol/L的的LF和LB引物，0.3～0.4 U/μL Bst DNA聚合酶，0.06～0.08 U/ μL逆转录酶。

6.一种权利要求1所述的酶反应体系的应用，其特征在于，所述的酶反应体系在制备检测新型冠状病毒试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括使用权利要求1-4中任意一种检测试剂盒检测新型冠状病毒的核酸，包括以下步骤：

在酶反应体系下进行扩增反应；

确定待测样品中是否存在新型冠状病毒的核酸。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括通过显色剂辅助判断反应结果是否为阳性的步骤。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的扩增反应为在60-65℃条件下反应30-60 min。

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一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒

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技术领域

[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒。背景技术

[0002]核酸检测涉及到提取、扩增、检测等环节，对实验室环境和操作人员要求较高，一个完整的新冠病毒核酸检测程序往往需要专业测试人员连续3小时以上的双手离台操作，涉及大型的荧光定量PCR仪，因此核酸检测的普及和现场应用受到限制，进而导致了大量疑似病例患者和密切接触人群不能够及时得到确诊，同时由于某些方法由于反应体系灵敏度较低容易造成检测结果的假阴性从而出现漏检问题。因此有必要开发一种操作便捷、检测快速、灵敏度高的新型冠状病毒检测反应体系/试剂盒。[0003]环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展起来的一种新型等温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件保温约60 min，即可完成核酸扩增反应。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、等温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及操作便捷、检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点。新冠疫情爆发后，研究人员基于LAMP原理研制了新冠病毒的检测方法，如Yinhua Zhang et al. (2020)[文献见：Rapid Molecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus RNA Using Colorimetric LAMP. doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.26.20028373 ]以新型冠状病毒的ORF和N基因设计了LAMP扩增引物，其中检测灵敏度较高的包含引物组NA的反应体系最低可检测到120拷贝的RNA。为了进一步提高检测灵敏度，降低假阴性和漏检率，本发明对其反应体系作了进一步优化。

发明内容

[0004]本发明的目的在于：提供一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒。[0005]本发明的又一目的在于：提供上述检测试剂盒检测新型冠状病毒的核酸的应用。[0006]本发明目的通过下述方案实现：一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，含有酶反应体系，通过在酶反应体系下进行扩增反应，确定待测样品中是否存在新型冠状病毒的核酸；

所述的酶反应体系中至少包括扩增引物中的第一引物组、第二引物组或者第三引物组中的一组；

所述的第一引物组含有上游外引物F3：5’-TGGCTACTACCGAAGAGCT-3’ (SEQ ID NO：1)和S下游外引物B3：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGAT-3’ (SEQ ID NO：2)；

所述的第二引物组含有上游内引物FIP：5’-TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG-3’ (SEQ ID NO：3)和下游内引物BIP：5’-AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT-3’(SEQ ID NO：4)；

所述的第三引物组含有上游环引物LF：5’-GGACTGAGATCTTTCATTTTACCGT-3’(SEQ ID NO：5)和上游环引物LF：5’- ACTGAGGGAGCCTTGAATACA -3’ (SEQ ID NO：6)。

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本发明通过LAMP反应体系/试剂的优化，克服当前新型冠状病毒分子检测领域中

所遇到的由于操作复杂、检测时间长而造成大量疑似病例患者和密切接触人群不能够及时得到确诊，以及由于反应体系灵敏度较低易造成检测结果呈假阴性从而出现漏检的问题。[0008]本发明通过LAMP反应体系/试剂的优化，克服当前新型冠状病毒分子检测领域中所遇到的由于操作复杂、检测时间长而造成大量疑似病例患者和密切接触人群不能够及时得到确诊，以及由于反应体系灵敏度较低易造成检测结果呈假阴性从而出现漏检的问题。[0009]本发明所优化的LAMP反应体系制备的试剂盒，操作简便、检测时间短，灵敏度高，降低了假阴性和漏检率。

[0010]为了进一步提高检测灵敏度，降低假阴性和漏检率，本发明对其反应体系作了进一步优化，并在此基础上完成本发明。[0011]较好的，所述的酶反应体系还包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg2+、甜菜碱、dNTP、Bst DNA聚合酶中的一种或者几种。[0012]更好的，所述的试剂盒酶反应体系还包括逆转录酶。例如，所述逆转录酶包括AMV酶。

[0013]更好的，新型冠状病毒核酸的检测试剂盒还含有显色剂；

所述的显色剂选自：Sybr Green I、Genefinder或GelRed。[0014]较好的，所述试剂盒包括酶反应体系和显色剂，通过在酶反应体系下进行等温扩增反应，通过显色剂辅助判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在新型冠状病毒。

[0015]在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒酶反应体系包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg2+、甜菜碱、dNTP、引物、Bst DNA聚合酶和逆转录酶。[0016]本发明所述的试剂盒中，各组分的浓度为工作浓度，在保存、运输的过程中，各组分的浓度可为工作浓度的2～100倍。各组分可以独立存在也可以预混合存在，例如，所述试剂盒包括缓冲液、酶和显色剂三个独立存在的试剂，其中预混试剂缓冲液包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg2+、甜菜碱和dNTP、引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，预混试剂酶包括Bst DNA聚合酶和逆转录酶；也可以包括缓冲液、引物、酶和显色剂四个独立存在的试剂，其中预混试剂缓冲液包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg2+、甜菜碱、dNTP，预混试剂引物包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，预混试剂酶包括Bst DNA聚合酶和逆转录酶。[0017]在本发明的一个优选实施例中，提供了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒酶反应体系包括：1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，6 mmol/L Mg2+，0.6 mol/L的甜菜碱、1.2 mmol/L dNTP，浓度分别为0.2 μmol/L的F3和B3引物，浓度分别为1.6 μmol/L的FIP和BIP引物，浓度分别为0.4 μmol/L的LF和LB引物，0.3～0.4U/ μL Bst DNA聚合酶，0.06～0.08 U/ μL逆转录酶。[0018]其中，1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，10mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，0.1% Triton X-100，2mM MgSO4。

[0019]本发明的试剂盒还可以含有阳性对照、阴性对照、反应容器、辅助工具、说明书等。[0020]本发明的检测试剂盒可以通过常规技术方法制备获得。[0021]例如，所述的引物组可以通过人工合成，根据引物序列逐个/逐段连接形成完整的

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引物。

另一方面，本发明提供了上述酶反应体系的应用，即所述的引物组在制备检测新

型冠状病毒试剂中的应用。[0023]较好的，所述的应用包括使用上述新冠病毒核酸检测试剂盒检测新型冠状病毒的核酸。

[0024]所述的应用包括以下步骤：

在酶反应体系下进行扩增反应；

确定待测样品中是否存在新型冠状病毒的核酸。[0025]所述的核酸包括DNA、RNA或者其衍生物。

[0026]本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂盒在使用时，所述等温扩增反应为在60-65℃条件下反应30-60 min，其中优选630C 40 min。所述等温扩增反应可以在普通PCR仪、荧光定量PCR仪、水浴锅、电加热器等控温装置上进行。[0027]较好的，所述的应用还包括通过显色剂辅助判断反应结果是否为阳性的步骤。[0028]较好的，所述的扩增反应为在60-65℃条件下反应30-60 min。[0029]其中优选63℃ 40 min。所述等温扩增反应可以在普通PCR仪、荧光定量PCR仪、水浴锅、电加热器等控温装置上进行。

[0030]本发明提供的新型冠状病毒核酸检测试剂盒中，所述显色剂选自Sybr Green I、Genefinder或GelRed。显色结果可通过肉眼观察，或借助紫外灯进行观察，当借助紫外灯观察时，所用波长为254 nm，365 nm，优选254 nm。

[0031]基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。[0032]本发明提供了一种新型冠状病毒核酸检测试剂/试剂盒，对当前的新型冠状病毒疫情防控具有较大意义。本发明有益效果包括：采用本发明新型冠状病毒检测反应体系/试剂盒具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高等优点。与目前常用检测方法相比，本发明采用的等温扩增法，可以在等温条件下进行，只需采用简单的控温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，不需要对扩增产物进行电泳检测等步骤，因而，非常适于广泛应用检测部门推广使用，即使在分子生物学专业知识和技能基础相对不足的环境下也可充分应用。与目前已有的新型冠状病毒LAMP检测方法（如前文所述的Yinhua Zhang et al的方法）相比，具有更好的灵敏度。本发明检测试剂盒具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高的特点，可以加快疑似病例患者和密切接触人群检测速度，同时最大限度地避免当前由检测灵敏度低引致的漏检问题。

附图说明

[0033]附图1表明本发明实施例1以RNA标准物质为模板的试剂盒A灵敏度测试结果；

附图2表明本发明实施例2以RNA标准物质为模板的试剂盒B灵敏度测试结果；附图3表明本发明实施例3以RNA标准物质为模板的试剂盒C灵敏度测试结果；附图4表明本发明实施例4以假病毒RNA为模板的试剂盒灵敏度测试结果；附图5表明本发明实施例5以临床样品RNA为模板的试剂盒性能测试结果。

[0022]

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具体实施方式

[0034]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。[0035]实施例1

以RNA标准物质为模板的试剂盒A灵敏度测试

新型冠状病毒RNA样品为上海市计量测试技术研究院提供的体外转录RNA标准物质（包含核壳蛋白N基因全长、包膜蛋白E基因全长、开放阅读框1ab基因片段），编号GBE（E）091112，N基因浓度为2.9×107拷贝/μL。[0036]采用试剂盒A，试剂盒种类及主要组成成分见表1，逆转录酶浓度为0.06 U/μL，Bst DNA聚合酶浓度为0.3U/μL，其他成份按照表2中本发明试剂盒检测新型冠状病毒的反应体系中所述条件，配制反应体系，RNA模板按照2×104、2×103、2×102、20、5、2、1和0拷贝加入反应体系，然后63℃条件下进行等温扩增反应40 min，82℃下终止反应7 min；反应后加入2.5 μL显色剂Sybr Green I（终浓度50×）。肉眼观察显色结果，或是在紫外灯下进行扩增结果确认。

[0037]如图1所示1-8分别为2×104、2×103、2×102、20、5、2、1和0拷贝，其中，上图为肉眼观察结果，下图为254 nm紫外光下观察结果。图1中，肉眼观察，2×104、2×103、2×102、20、5、2和1拷贝处理的反应产物呈现为绿色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为橙色，为阴性结果；紫外灯下观察，2×104、2×103、2×102、20、5、2和1拷贝处理的反应产物呈现为亮白色或亮绿色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为暗绿色，为阴性结果。检测结果表明，每个反应管中最低含1拷贝的RNA时仍可被检出，灵敏度较高。[0038]实施例2

以RNA标准物质为模板的试剂盒B灵敏度测试采用试剂盒B的预混试剂套装，见表1，试剂1～4、试剂5～10、试剂11～12分别制备成预混试剂I、II、III，按照实施例1所述反应体系和条件进行等温扩增检测。反应后加入2.5 μL显色剂Genefinder（终浓度40×）。肉眼观察显色结果，或是在紫外灯下进行扩增结果确认。[0039]如图2所示1-8分别为2×104、2×103、2×102、20、5、2、1和0拷贝，其中上图为肉眼观察结果，下图为254 nm紫外光下观察结果。图2中，肉眼观察，2×104、2×103、2×102、20、5、2和1拷贝处理的反应产物呈现为绿色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为橙色，为阴性结果；紫外灯下观察，2×104、2×103、2×102、20、5、2和1拷贝处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为暗绿色，为阴性结果。检测结果表明，每个反应管中最低含1拷贝的RNA时仍可被检出，灵敏度较高。[0040]实施例3

以RNA标准物质为模板的试剂盒C灵敏度测试采用试剂盒C的预混试剂套装，见表1，试剂1～10、试剂11～12分别制备成预混试剂I、II，按照实施例1所述反应体系和条件进行等温扩增检测。反应后加入2.5 μL显色剂GelRed（终浓度50×）。在紫外灯下进行扩增结果确认。

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如图3所示1-8分别为2×104、2×103、2×102、20、5、2、1和0拷贝，其中上图为肉眼

观察结果，下图为254 nm紫外光下观察结果。图3中，肉眼观察，各阳性处理及阴性对照的反应产物均呈现为粉色；紫外灯下观察，2×104、2×103、2×102、20、5、2和1拷贝处理的反应产物呈现为亮粉色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为暗粉色，为阴性结果。检测结果表明，每个反应管中最低含1拷贝的RNA时仍可被检出，灵敏度较高。[0042]实施例4

以假病毒RNA为模板的试剂盒灵敏度测试

新冠假病毒样品FNV-2019-ncov-N为上海复百澳生物科技有限公司提供（货号：FNV2565，浓度108拷贝/ml）。将假病毒样品进行系列稀释，然后每个稀释样品取200 μL，采用TaKaRa核酸提取试剂盒（货号：9766）按照说明书进行RNA抽提，用50 μL水洗脱。[0043]采用试剂盒B，见表1，按照实施例2的反应体系，在每个反应体系里加入5 μL抽提好的假病毒RNA，按照实施例2的反应条件进行等温扩增检测和结果确认。[0044]如图4所示1-7分别为模板为104、103、102、10、2、1和0拷贝假病毒的RNA，其中上图为肉眼观察结果，下图为254 nm紫外光下观察结果。图4中，肉眼观察，模板为104、103、102、10、2和1拷贝假病毒RNA处理的反应产物呈现为绿色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为橙色，为阴性结果；紫外灯下观察，104、103、102、10、2和1拷贝处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为暗绿色，为阴性结果。检测结果表明，每个反应管中最低含1拷贝假病毒的RNA时仍可被检出，灵敏度较高。[0045]实施例5

以临床样品RNA为模板的试剂盒性能测试

4个临床样品为上海市临床检验中心提供的新型冠状病毒核酸检测测量审核样品（编号分别为2013、2014、2015、2016，其中2013为阴性样品；其余3个样品为阳性样品，其中2016为低浓度阳性样品），由已经灭活的临床样本制备而成。4个样品分别采用TaKaRa核酸提取试剂盒（货号：9766）按照说明书进行RNA抽提。[0046]采用试剂盒A，见表1，逆转录酶浓度为0.08 U/μL，Bst DNA聚合酶浓度为0.4 U/μL，其他成份按照实施例1的反应体系，且每个反应体系里加入5 μL抽提好的测量审核样品的RNA，同时设阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为上海市计量测试技术研究院提供的体外转录RNA标准物质，阴性对照为DEPC水）和反应条件，进行等温扩增检测和结果确认。[0047]如图5所示，1-4分别为编号为2013、2014、2015、2016的测量审核样品，5为阳性对照，6为阴性对照，上图为肉眼观察结果，下图为365 nm紫外光下观察结果。[0048]图5中，肉眼观察，编号为2014、2015、2016的测试审核样品及阳性对照的反应产物呈现为绿色，为阳性结果，编号为2013的测试审核样品和阴性对照的反应产物为橙色，为阴性结果；紫外灯下观察，编号为2014、2015、2016的测试审核样品及阳性对照的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，编号为2013的测试审核样品和阴性对照的反应产物为暗绿色，为阴性结果。检测结果表明，采用本发明提供的试剂盒进行的核酸检测结果与实际样品相符，且低浓度样本也可被检出，灵敏度较高

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序　列　表

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SEQUENCE LISTING<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司<120> 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒<130> DL20181<160> 6<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> 人工序列<400> 1tggctactac cgaagagct 19<210> 2<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> 人工序列<400> 2tgcagcattg ttagcaggat 20<210> 3<211> 41<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> 人工序列<400> 3tctggcccag ttcctaggta gtccagacga attcgtggtg g 41<210> 4<211> 40<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> 人工序列<400> 4agacggcatc atatgggttg cacgggtgcc aatgtgatct 40

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序　列　表

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<210> 5<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> 人工序列<400> 5ggactgagat ctttcatttt accgt 25<210> 6<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> 人工序列<400> 6actgagggag ccttgaatac a 21

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