检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112415195 A(43)申请公布日 2021.02.26

(21)申请号 202011477766.0(22)申请日 2020.12.15

(71)申请人 武汉大学

地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山

武汉大学(72)发明人 刘为勇　张祺　刘芳　刘映乐　

屈三甫　梅益　(74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务

所(特殊普通合伙) 42222

代理人 张火春(51)Int.Cl.

G01N 33/569(2006.01)C12N 15/10(2006.01)

权利要求书1页 说明书8页序列表7页 附图2页

(54)发明名称

检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用

(57)摘要

本发明提供了一种针对新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白的核酸适配体检测试剂盒，还提供了试剂盒的制备方法和应用。此试剂盒检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、有着良好的市场前景。

CN 112415195 ACN 112415195 A

权　利　要　求　书

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1.一种快速检测新冠病毒双靶点的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有新冠病毒S蛋白的核酸适配体和新冠病毒N蛋白的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。

2.根据权利要求1所述的检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征在于新冠病毒S蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，新冠病毒N蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的。

4.根据权利要求3所述的检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.4组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.4组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH8.0组成的。

5.根据权利要求1所述的检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征在于核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。功能基团通过共价键的方式连接到核酸适配体的5’端。

6.一种制备权利要求1中检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征是，新冠病毒S蛋白的核酸适配体以新冠病毒S蛋白靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；新冠病毒N蛋白的核酸适配体以新冠病毒N蛋白靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.4所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；再将荧光基团以共价键的形式连接到核酸适配体的5’端。

7.权利要求1中所述检测的试剂盒在同时检测新冠病毒双靶点中的应用。

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检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用

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技术领域

[0001]本申请涉及生物体外检测，具体地说，本发明涉及同时检测新冠病毒双靶点的试剂盒，制备试剂盒的方法，以及试剂盒在同时检测新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白样本中的应用。

背景技术

[0002]新型冠状病毒(2019-nCoV、SARS-CoV-2)是一种可以感染人的冠状病毒。冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。SARS-CoV-2的人际传播主要通过与感染者的密切接触发生，主要是通过呼吸道飞沫和接触受污染物体。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前新冠病毒的防控形势依旧严峻，对于新冠病毒的检测主要通过病毒核酸检测，同时对于疑似患者的抗体检测可以对诊断起到辅助作用，确诊病例需有病原学证据阳性结果(实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源)。

[0003]对于新冠病毒样品的检测在临床检测以及实验研究中十分重要。现有的技术中对于病毒感染或者病毒蛋白的检测多采用特异性的抗体进行识别，制备比较复杂，步骤比较繁琐，成本较高，在大规模推广中有一定的缺陷。核酸适配体是一段单链核酸(一般大小在20～60个碱基左右)，能通过折叠形成特定的三维结构并与相对应的靶分子进行高亲和力、高特异性的结合。核酸适配体可以通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选得到，是一种具有识别功能的新型核酸分子。利用SELEX技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性的与靶物质高度亲和的核酸适配体，该技术已经成功的运用于许多靶物质的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。该技术具有库容量大、适应范围广泛、分辨率高、亲和力高，筛选过程相对简便、快速、经济，实用性高等特点。适配体对应靶标物质的高特异性和高亲和性的特点与抗体的功能类似，但是适配子的靶标范围更加的广泛，可以很好地运用于医学检测、诊断和治疗等多个方面。

[0004]核酸适配体具有特异性和高亲和力的原因是单链核酸在遇到靶标分子时可以形成例如口袋、发卡、G-四聚体等独特的三维结构，这些结构在结合靶标分子时的原理与抗体特异性识别相应抗原决定簇的原理类似，例如通过氢键、疏水结构、离子键等与靶标分子特异性的结合。基于适配体具有较高特异性地识别病原微生物或者病变细胞的生物学特性，核酸适配体能被广泛的应用于检测技术以及生物传感器的构建，能够实现对于病原体或者疾病的精准诊断。

[0005]目前市面上针对新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白的抗原检测试剂盒都是单通道检测，也就是一次反应只能检测一种抗原，无法做到同一个反应中对两种或两种以上病毒抗

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原的检测。而且市售抗原检测试剂盒用的是抗体检测，抗体作为一种蛋白成分，具有不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等缺点。婴幼儿腹泻仅是一种症状和表现形式，其病原体有时是单一的，但也有很大比例是混合感染，快速诊断显得尤为重要。目前市面上还没有此类检测方法。

发明内容

[0006]本发明的目的是提供一种快速检测新冠病毒感染的试剂盒，使用该试剂盒可同时检测样本中是否存在新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白，灵敏度高，双通道同时快速检测。[0007]本发明的再一个目的是提供制备试剂盒的方法

[0008]本发明的第三个目的是提供试剂盒在检测新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白样本中的应用。

[0009]本发明公开了一种快速检测新冠病毒双靶点的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有新冠病毒S蛋白的核酸适配体和新冠病毒N蛋白的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。[0010]本发明还公开了核酸适配体的核苷酸序列，本发明中新冠病毒S蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，新冠病毒N蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

[0011]本发明公开的检测新冠病毒双靶点的试剂盒中的组分A)固定样本溶液的蛋白包被板可采用普通的ELISA板包初上阳性或待检测样品，直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板。

[0012]本发明继续公开了试剂盒的组成，其中B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，其中C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，其中D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，其中E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的。[0013]在一个优先方案中，本发明还公开了A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.4组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.4组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH8.0组成的。[0014]本发明公开的核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。

[0015]本发明还公开了制备检测新冠病毒双靶点的试剂盒方法，新冠病毒S蛋白的核酸适配体以新冠病毒S蛋白靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；新冠病毒N蛋白的核酸适配体以新冠病毒N蛋白靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.4所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；再联接上的荧光基团，但要求两个核酸适配体连接的荧光基团相异，以便观察和识别。

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本发明还公开了检测的试剂盒在同时检测新冠病毒双靶点中的应用

[0017]为了实现本发明中，申请人通过下列方式制备检测新冠病毒双靶点的试剂盒。[0018]1)确定待测病毒的靶蛋白抗原表位[0019]通过文献查阅与生物信息学分析，本发明人确定了新冠病毒S蛋白靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示以及新冠病毒N蛋白靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0020]2)筛选特异性结合的核酸适配体序列

[0021]体外合成一个含有39个随机序列的单链DNA文库；以新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白靶蛋白为筛选条件，采用SELEX技术筛选出具有高特异性、高亲和力的DNA适配体序列，新冠病毒S蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，新冠病毒N蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

[0022]3)合成带有荧光基团标记的核酸适配体

[0023]直接在常规生物技术服务公司合成筛选得到的核酸适配体序列，合成时以共价键的形式在核酸适配体5’端连上荧光基团。检测新冠病毒S蛋白的核酸适配体具有如SEQ ID No.1所示序列，所带荧光基团为FAM；检测新冠病毒N蛋白的核酸适配体具有如SEQ ID No.2所示序列，所带荧光基团为VIC。[0024]4)制备试剂盒

[0025]试剂盒包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，核酸适配体含有新冠病毒S蛋白的核酸适配体和新冠病毒N蛋白的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。[0026]试剂盒中试剂组分配方如下：B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的，F)核酸适配体由公司合成粉剂，溶于TE缓冲液中，工作浓度为200nM。

[0027]本发明通过SELEX技术筛选到的针对新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白的核酸适配体对相应的靶病毒具有较高的特异性和亲和力，并且具有无免疫原性、分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒等优点。利用本发明筛选到的核酸适配体进行的检测方法对相应的病毒进行检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，利用该核酸适配体构建分子探针或者检测试剂盒，并结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。同时该试剂盒有较宽的检测范围，便于临床实用。

[0028]本发明的意义在于：试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、适合大规模推广，有着良好的市场前景。[0029]本发明的优点是

[0030]1.在新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白感染病人唾液样本和健康人唾液样本的检测中，新冠病毒S蛋白感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96.3％；新冠病毒N蛋白感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96.8％；健康人群检测的阳性检出率为0％。

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2.双通道同时检测两种核酸适配体标记上两种不同发射波段的荧光基团，能在同

一个反应体系中同时完成两种病原体检测，相对于市面上普通的免疫检测试剂盒(如胶体金试剂盒)来说，缩短了反应时间，节省了反应试剂与待测样本用量。

[0032]3.独特的核酸适配体序列本发明所用核酸适配体序列为通过SELEX技术筛选所得，具有完全的独创性。

[0033]本试剂盒采用核酸适配体作为检测物，能有效克服以上问题，它具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点。通过在不同核酸适配体上标记不同荧光基团，能做到在同意反应中对两种及两种以上并病原的同时检测。附图说明

[0034]图1是本发明核酸适配体中新冠病毒S蛋白-aptamer核苷酸序列的二级结构图；[0035]图2是本发明核酸适配体中新冠病毒N蛋白-aptamer核苷酸序列的二级结构图。具体实施方式

[0036]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。[0037]实施例1确定新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白的靶蛋白抗原表位[0038]根据文献查阅与生物信息学分析，确定待测适合作为核酸适配体检测靶点的病毒蛋白以及病毒蛋白上的具体抗原表位区域。

[0039]A)选择新型冠状病毒S蛋白全长作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ ID No.3所示序列：

[0040]MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID No.3)

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B)选择新型冠状病毒N蛋白全长作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ ID No.4所示

序列：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPR

GQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA(SEQ ID No.4)[0043]C)根据已确定的氨基酸序列，直接在公司进行核苷酸序列的合成以及原核密码子优化，将合成的基因片段插入原核表达载体pET32a上。诱导表达出相应用于适配体筛选的两种病毒的靶蛋白。

[0044]实施例2构建适配体文库与引物设计

[0045]A)通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，体外合成含有39个随机序列的单链DNA文库，其核苷酸序列如下

[0046]GATGACATTGCACAAGTCAGG-(N39)-GAGTGAATCCTGCTGTTCGA[0047]B)针对核酸适配体5’端固定序列，设计合成的上游引物P1，具有如SEQ ID No.5所示序列：[0048]5’-GATGACATTGCACAAGTCAGG-3’(SEQ ID No.5)[0049]C)针对核酸适配体3’端固定序列，设计合成的下游引物P2，具有如SEQ ID No.6所示序列，同时在引物5’端连接有生物素基团：5’-biotin-TCGAACAGCAGGATTCACTC-3’(SEQ ID No.6)

[0050]实施例3利用SELEX筛选技术，从文库中筛选得到能有效结合病毒靶蛋白的核酸适配体序列

[0051]A)将10nmol的初始单链DNA随机文库溶解在500μl的PBS溶液中，用92℃的恒温水浴锅水浴5min，之后迅速的插入冰中冰浴10min，之后将经过处理的初始单链DNA随机文库与相应病毒靶蛋白在冰上孵育1h，再加入Ni-NTA Magnetic Agarose Beads，继续孵育1h。孵育完成后，使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤Beads。最后用10ml预冷的PBS重悬Beads，使之充分吹打混匀，之后92℃恒温水浴10min，13000g离心，收集上清，即为第一轮筛选后特异性识别病毒靶蛋白的单链DNA文库。[0052]B)对筛选后的单链DNA文库进行PCR扩增，以制备次级文库。PCR反应的体系如下：Premix Tap Mix 25μl，筛选后的单链DNA文库8μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，ddH2O 12μl，总体积为50μl。按照如下的程序进行PCR循环扩增：95℃变性3min，经过35个循环扩增程序为95℃30s，55℃30s，72℃30s，最终的延伸为72℃10min，最后维持在16℃终止反应。对经过PCR扩增后的文库进行琼脂糖凝胶回收以得到纯净的文库片段。[0053]C)对扩增得到的次级文库进行进一步的制备。将扩增后的双链DNA文库与100μl链酶亲和素标记的磁珠常温孵育20min，利用双链DNA文库上的生物素与链酶亲和素的亲和作用将双链DNA文库结合到磁珠的表面，之后使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤磁珠。加入终浓度为200mM的NaOH溶液常温反应10min使得双链DNA文库变性变成单链，其中带有生物素标记的一条链会结合在磁珠上，不带生物素标记的那一条链会脱离到上清液

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中。收集上清液，用脱盐柱除去NaOH，最后加入500μl的PBS，收集到的溶液即为下一轮筛选所需要用到的单链DNA文库。

[0054]D)重复上述的阳性筛选过程、PCR扩增以及次级单链DNA文库的制备过程15次，最后筛选得到的单链DNA文库对于病毒靶蛋白的识别能力最强。将所得到的单链DNA文库进行克隆测序后，最终得到了本发明中所筛选出来的可用于检测新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白感染的核酸适配体，其DNA序列分别为：[0055]新型冠状病毒S蛋白-aptamer

[0056]GATGACATTGCACAAGTCAGGGAGGTAATGGTCGGTCATGTAGGACCGGGACGACAGACGGAGTGAATCCTGCTGTTCGA

[0057]新型冠状病毒N蛋白-aptamer

[0058]GATGACATTGCACAAGTCAGGAGACTTGCTTTTTAATACAAGCTCGGCATAAACAGCTCTGAGTGAATCCTGCTGTTCGA

[0059]E)为了能在一个反应体系内同时进行两种反应产物的检测，给每种适配体5’端标记上不同的荧光基团(共价键结合的形式，直接在常规生物技术服务公司合成)，最终的试剂盒里的适配体信息如下：

[0060]新冠病毒S蛋白-aptamer，具有如SEQ ID No.1所示序列：[0061]5’-FAM-[0062]GATGACATTGCACAAGTCAGGGAGGTAATGGTCGGTCATGTAGGACCGGGACGACAGACGGAGTGAATCCTGCTGTTCGA-3’(SEQ ID No.1)[0063]新冠病毒N蛋白-aptamer，具有如SEQ ID No.2所示序列：[0064]5’-VIC-[0065]GATGACATTGCACAAGTCAGGAGACTTGCTTTTTAATACAAGCTCGGCATAAACAGCTCTGAGTGAATCCTGCTGTTCGA-3’(SEQ ID No.2)[0066]实施例4适配体的验证[0067]A)通过结构预测软件RNA Structure Program来分析预测筛选出来的核酸适配体的二级结构，结果显示所有的核酸适配体都可以形成特殊的茎环结构和发卡结构。新冠病毒S蛋白-aptamer可形成如图1所示的二级结构，新冠病毒N蛋白-aptamer可形成如图2所示的二级结构。

[0068]B)使用ForteBio Octet RED96相互作用分析仪检测核酸适配体与靶蛋白的结合力，所得结果如下：适配体与靶蛋白的解离常数Kd(nM)

新冠病毒S蛋白-aptamer8.1新冠病毒N蛋白-aptamer8.3PBS对照无结合

[0070]C)分别采用人血白蛋白、免疫血清球蛋白、唾液淀粉酶蛋白与2种核酸适配体进行特异性检测，经过结合实验发现，2种适配体都不与这些蛋白结合。用2种病毒的靶蛋白对2种适配体进行交叉反应检测，实验结果显示，2种适配体只与对应的靶蛋白结合。[0071]D)2种适配体各取0.2μg，分别放置于常温血清、水溶液中。4周后用RT-PCR检测，发现放置的核酸适配体结构稳定，没有发生降解。

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E)用新型冠状病毒感染敏感宿主细胞，同时设置没有感染的阴性对照组。感染36h

后用胰酶消化细胞，离心得到细胞沉淀并去除上清液，再用PBS重悬。对细胞进行固定与透化处理，再将对应新型冠状病毒的带有荧光基团标记的核酸适配体分别与感染病毒的细胞悬液以及未感染对照组细胞悬液混合处理1h，通过流式细胞仪分析计算。不同的核酸适配体标记了不同的荧光基团，可以在流式细胞仪中明显区分，结果显示感染了新型冠状病毒的细胞样品所对应的核酸适配体标记荧光数值显著升高，说明筛选得到的适配体可用作病毒感染的检测。[0073]实施例5，试剂盒的配方[0074]本试剂盒包含以下配方：

[0075]1)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板[0076]2)蛋白包被液[0077]3)封闭液[0078]4)漂洗液

[0079]5)样本前处理液

[0080]6)带有荧光基团标记的核酸适配体[0081]实施例6，试剂盒的制备

[0082]本试剂盒所有配方的制备信息如下：

[0083]1)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板

[0084]2)蛋白包被液[0085]属于常规分子检测试剂，配方为35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9，使用双蒸水配置。[0086]3)封闭液[0087]属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。[0088]4)漂洗液[0089]属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。[0090]5)样本前处理液[0091]属于常规分子检测试剂，配方为150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2，使用双蒸水配置。

[0092]6)带有荧光基团标记的核酸适配体

[0093]通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，直接合成，用TE缓冲液溶解并配置到工作浓度(200nM)。[0094]实施例7，试剂盒的应用

[0095]取20份已确认新冠病毒S蛋白阳性的样本、20份已确认新冠病毒N蛋白阳性的样本与20份已确认无新冠病毒S蛋白、无新冠病毒N蛋白的对照样本。由于目前市场上没有同时检测新冠病毒S蛋白与新冠病毒N蛋白的抗原检测试剂盒，所以取市售某品牌新冠病毒S蛋白抗原检测试剂盒与市售某品牌新冠病毒N蛋白抗原检测试剂盒与我们的核酸适配体检测

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说　明　书

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试剂盒同时做平行实验。实验结果如下：

[0096]

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序　列　表

                         序列表<110>  武汉大学<120>  检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用<160>  6<170>  SIPOSequenceListing 1.0<210>  1<211>  80<212>  DNA<213>  人工序列(Artificial Sequence)<400>  1gatgacattg cacaagtcag ggaggtaatg gtcggtcatg taggaccggg acgacagacg      gagtgaatcc tgctgttcga                                                  <210>  2<211>  80<212>  DNA<213>  人工序列(Artificial Sequence)<400>  2gatgacattg cacaagtcag gagacttgct ttttaataca agctcggcat aaacagctct      gagtgaatcc tgctgttcga                                                  <210>  3<211>  1273<212>  PRT<213>  人工序列(Artificial Sequence)<400>  3Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val1               5                   10                  15Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe            20                  25                  30Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu        35                  40                  45His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp    50                  55                  60Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp65                  70                  75                  80Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu                85                  90                  95Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser            100                 105                 110

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60806080CN 112415195 A

序　列　表

2/7页

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile        115                 120                 125Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr    130                 135                 140Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr145                 150                 155                 160Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu                165                 170                 175Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe            180                 185                 190Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr        195                 200                 205Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu    210                 215                 220Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr225                 230                 235                 240Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser                245                 250                 255Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro            260                 265                 270Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala        275                 280                 285Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys    290                 295                 300Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val305                 310                 315                 320Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys                325                 330                 335Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala            340                 345                 350Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu        355                 360                 365Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro    370                 375                 380Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe385                 390                 395                 400Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly                405                 410                 415Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

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序　列　表

3/7页

            420                 425                 430Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn        435                 440                 445Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe    450                 455                 460Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys465                 470                 475                 480Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly                485                 490                 495Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val            500                 505                 510Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys        515                 520                 525Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn    530                 535                 540Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu545                 550                 555                 560Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val                565                 570                 575Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe            580                 585                 590Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val        595                 600                 605Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile    610                 615                 620His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser625                 630                 635                 640Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val                645                 650                 655Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala            660                 665                 670Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala        675                 680                 685Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser    690                 695                 700Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile705                 710                 715                 720Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val                725                 730                 735

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序　列　表

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Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu            740                 745                 750Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr        755                 760                 765Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln    770                 775                 780Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe785                 790                 795                 800Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser                805                 810                 815Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly            820                 825                 830Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp        835                 840                 845Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu    850                 855                 860Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly865                 870                 875                 880Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile                885                 890                 895Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr            900                 905                 910Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn        915                 920                 925Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala    930                 935                 940Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn945                 950                 955                 960Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val                965                 970                 975Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln            980                 985                 990Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val        995                 1000                 1005Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn Leu    1010                 1015                 1020Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys Arg Val1025                 1030                 1035                 1040Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro Gln Ser  Ala

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序　列　表

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                1045                 1050                 1055Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val Pro Ala  Gln Glu            1060                 1065                 1070Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His Asp Gly  Lys Ala His        1075                 1080                 1085Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn Gly Thr  His Trp Phe Val    1090                 1095                 1100Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr1105                 1110                 1115                 1120Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr                1125                 1130                 1135Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu            1140                 1145                 1150Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp        1155                 1160                 1165Ile Ser  Gly Ile Asn Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp    1170                 1175                 1180Arg  Leu Asn Glu Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu1185                 1190                 1195                 1200Gln Glu Leu Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile                1205                 1210                 1215Trp Leu Gly Phe  Ile Ala Gly Leu Ile  Ala Ile Val Met Val  Thr Ile            1220                 1225                 1230Met Leu Cys  Cys Met Thr Ser Cys  Cys Ser Cys Leu Lys  Gly Cys Cys        1235                 1240                 1245Ser Cys  Gly Ser Cys Cys Lys  Phe Asp Glu Asp Asp  Ser Glu Pro Val    1250                 1255                 1260Leu  Lys Gly Val Lys Leu  His Tyr Thr1265                 1270<210>  4<211>  419<212>  PRT<213>  人工序列(Artificial Sequence)<400>  4Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr1               5                   10                  15Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg            20                  25                  30Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

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序　列　表

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        35                  40                  45Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu    50                  55                  60Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro65                  70                  75                  80Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly                85                  90                  95Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr            100                 105                 110Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp        115                 120                 125Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp    130                 135                 140His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln145                 150                 155                 160Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser                165                 170                 175Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn            180                 185                 190Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala        195                 200                 205Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu    210                 215                 220Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln225                 230                 235                 240Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys                245                 250                 255Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln            260                 265                 270Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp        275                 280                 285Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile    290                 295                 300Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile305                 310                 315                 320Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala                325                 330                 335Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu            340                 345                 350

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序　列　表

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro        355                 360                 365Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln    370                 375                 380Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu385                 390                 395                 400Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser                405                 410                 415Thr Gln Ala<210>  5<211>  21<212>  DNA<213>  人工序列(Artificial Sequence)<400>  5gatgacattg cacaagtcag g                                                <210>  6<211>  20<212>  DNA<213>  人工序列(Artificial Sequence)<400>  6tcgaacagca ggattcactc                                                  17

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说　明　书　附　图

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图1

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说　明　书　附　图

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图2

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