生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定

任士伟;邢小霞;董向丽

【摘 要】30 Strains of Bacillus spp. were isolated from 7 soil samples using repeated plate streaking, and 4 strains of them had rivalry ability to Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum. They had also antagonism effect and broad spectrum to other plant pathogenic fungi proved by the method of plate test. We detected that the secondary metabolites of Bacillus spp. had fungistasis and could induce deformed growth of hyphae, the metabolites had water-solubility ability. The hyphae of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum et al. could be induced bulge, browning, tip dulled. produced sporule by zymotic fluid. A strain of Bacillus subtilis was preliminary identified through observation of its morphological features and culture characters and a series of biochemical experiments.%从不同环境中采集7份土壤样品用于芽孢杆菌的分离纯化,通过多次平板划线分离纯化得到30个菌落形态不同的菌株.以黄瓜枯萎病菌为指示菌对得到的菌株进行抑菌活性筛选,其中的4个菌株具有明显的抑菌作用.采用对峙生长法,测定4株芽孢杆菌对其它植物病原真菌的活性,结果显示4个芽孢杆菌均具有广谱抑菌性.进一步试验表明,4株芽孢杆菌的发酵液也具有明显的抑菌作用,说明对病原真菌有抑制作用的物质水溶性较大,大部分释放到发酵液中,并且发酵液可使黄瓜枯萎等植物病原真菌菌丝膨大、褐变、末端钝圆,促进镰刀菌产生小孢子.通过菌落形态特征、系列生化测定对其进行初步鉴定,结果表明其中一株为枯草芽孢杆菌. 【期刊名称】《现代农药》

【年(卷),期】2011(010)001 【总页数】4页(P44-47)

【关键词】芽孢杆菌;拮抗作用;植物病原真菌;发酵液 【作 者】任士伟;邢小霞;董向丽

【作者单位】青岛农业大学农学与植物保护学院,山东青岛266109;青岛农业大学农学与植物保护学院,山东青岛266109;青岛农业大学农学与植物保护学院,山东青岛266109 【正文语种】中 文 【中图分类】S482.2+92

植物病害是影响农业生产的主要因素之一，其中80%以上为真菌病害[1]，目前对其防治主要以化防为主，但化学农药常常导致“3R”等负面影响，利用微生物及其所产生的抗菌物质进行植物病害生物防治具有很大的应用价值和潜力。 微生物可产生多种抗菌物质，从中分离天然活性物质已成为新农药创制的热点，其中芽孢杆菌(Bacillus spp.) 可产生脂肽类和抗菌蛋白等几十种不同的抗菌物质，不仅数量多，而且产量丰富，且芽孢杆菌抗病抑菌机制还包括竞争作用和诱导植物抗病性等，在病害生物防治中具有很高的应用价值[2]。芽孢杆菌是土壤和植物微生态的优势微生物种群，是植物病害生防微生物的重要组成部分，由于其能产生抗逆性强的芽孢，对菌体的生存、剂型加工及其在环境中的存活和定殖都十分有利，因此它是一种理想的生防微生物，许多性状优良的拮抗菌株已成功地应用于植物病害生物防治中[3]，因此，筛选拮抗能力强的芽孢杆菌，从中分离抑菌活性物质，为

生物农药的开发提供基础资源，具有重要意义。 1 材料与方法 1.1 供试植物病原真菌

黄瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)，西瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，棉花枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani)，小麦赤霉病菌 (Gibberella zeae)，葡萄黒痘病菌 (Sphaceloma ampelinum) 和苹果轮纹病菌 (Botryosphaeria berengriana f.sp. piricola)，均由青岛农业大学农药学实验室提供。 1.2 培养基

供试培养基有NA培养基、PDA培养基、淀粉培养基和明胶培养基[4]，分别用以芽孢杆菌的分离纯化、抑菌试验、淀粉水解试验和明胶液化试验。 1.3 土样采集及芽孢杆菌的分离

从青岛农业大学周边面粉厂及青岛北九水梧桐树、杉木、柏树、松树、臭椿树和岩肤木等根部采集土样，采用稀释平板法分离芽孢杆菌。分离时，每份土样称取10 g放入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，高压灭菌15 min，取上清液均匀涂布于NA培养基表面，密封好后放于37℃下恒温箱中培养。2 d后取出，选择单个菌落用移液器挑取少许加入0.1 mL无菌水混匀制成菌悬液。然后按上述方法再接种到培养基上培养纯化。如此反复培养纯化，直至所有菌落形态、颜色一致则为单一菌株。记录菌落的形状、边缘、表面、光泽度、颜色、透明度等。 1.4 拮抗菌的初筛

以黄瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum) 为指示菌，采用PDA平板对峙生长法[5]筛选出对病菌生长具有明显抑制效果的菌株。 1.5 拮抗菌株对不同植物病原真菌的抑菌试验

同样采用平板对峙法将不同的病原真菌接种于PDA平板中央，在4个角上接种初

筛的芽孢杆菌，27℃培养3 d后观察结果。 1.6 拮抗菌株发酵液对植物病原真菌抑制作用测定

拮抗菌株发酵：通过拮抗菌复筛得到对植物病原真菌具有良好拮抗作用的菌株，进行发酵培养。培养基为马铃薯液体培养基，在温度为27℃的恒温水浴摇床上摇动培养60 h。然后将发酵液在10000 r/min离心15 min，取上清液再重复离心一次，得到的上清液即为芽孢杆菌抗菌物粗提液。

发酵液抑菌作用测定：采用环柱测定法[6]。从平板培养的病原菌菌落边缘处用打孔器打取直径0.6 cm的菌饼，置于直径6.0 cm的PDA平板培养基中央，在距菌饼周围1 cm处均匀打3个直径为0.4 cm的小孔，分别向孔中加入25 μL发酵粗提液，对照为无菌水。27℃培养60 h后测定发酵液对病原真菌的抑菌率。

1.7 拮抗菌发酵液对植物病原真菌形态影响

用拮抗菌发酵液抑制的植物病原真菌，27℃培养 60 h后，挑取抑菌圈边缘生长的病原菌丝，在40倍物镜下观察菌丝形态及一系列变化。 1.8 芽孢杆菌初步鉴定

对植物病原真菌抑制效果较好的拮抗菌株进行系列生化试验：革兰氏染色、芽孢染色[4]、明胶液化试验和淀粉水解试验[7]等。根据菌落形态及生化试验结果对拮抗芽孢杆菌进行初步鉴定[7-8]。 2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的分离纯化及拮抗菌株初筛

从不同土样中通过多次平板划线分离得到 30株形态各异的芽孢杆菌，结果如表1所示。

以黄瓜枯萎病菌为指示菌，采用对峙生长法，对上述 30株芽孢杆菌进行抑菌活性测定，结果筛选出拮抗效果明显的4个菌株：BN8、BN10、BN22和BN29。

2.2 拮抗菌株对其他植物病原真菌的抑制作用

采用对峙生长法测定4株拮抗菌株对西瓜枯萎病等6个植物病原真菌的拮抗作用，图1显示的是抑菌效果。培养皿中央是病原菌，四周分别是4个芽孢杆菌菌株。 图1 4株芽孢杆菌对6种植物病原真菌的拮抗作用A-黄瓜枯萎病菌；B-西瓜枯萎病菌；C-棉花枯萎病菌；D-小麦赤霉病菌；E-水稻纹枯病菌；F-葡萄黒痘病菌。4株芽孢杆菌位置：上-BN8，下-BN22，左-BN29，右-BN10

从图1可以看出，BN8、BN10、BN22和BN29对小麦赤霉病菌等6种植物病原真菌皆具有较好的拮抗作用，对菌落边缘菌丝的生长抑制作用明显，说明4株芽孢杆菌具有较强的拮抗能力且具有广谱性。其中BN8菌株拮抗能力最强，效果最明显，对病原真菌生长边缘的菌丝抑制明显，呈刀切状。BN10拮抗效果次之。 BN8对黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌及葡萄黑痘病菌抑菌效果优于其它菌株，对西瓜枯萎病的抑制效果与其它菌株相当；菌株BN10对所试的6种植物病原菌也表现出了良好的抑菌效果；4株芽孢杆菌对水稻纹枯病的抑菌作用较强，说明水稻纹枯病相对地对抗菌素类物质较敏感。 表1 不同菌株菌落培养性状来源 编号 形状 边缘 光泽度 表面 颜色 透明度BN1 圆形 整齐 无 略隆起 白色 不透明面粉厂周围BN2 近圆形 不整齐 无 略隆起 乳白色 不透明BN3 圆形 絮状 无 扁平 乳白色 不透明BN4 圆形 整齐 有 略隆起 黄白色 不透明BN5 圆形 絮状 无 扁平 白色 向外渐透明BN6 近圆形 波状 无 隆起 黄白色 向外渐透明BN7 不规则 假根状 无 扁平 白色 向外渐透明BN8 近圆形 不整齐 有 略隆起 黄白色 不透明BN9 圆形 不整齐 无 扁平 乳白色 不透明梧桐树下BN10 不规则 假根状 无 扁平 白色 向内渐透明BN11 圆形 整齐 无 隆起 白色 不透明BN12 圆形 整齐 有 略隆起 黄白色 不透明BN13 圆形 不整齐 无 扁平 白色 半透明杉树下BN14 近圆形 不整齐 无 略隆起 白色 不透明BN15 近圆形 不整齐 无 扁平 黄白色 不透明BN16 近圆形 不整齐 无 隆起 乳

白色 不透明BN17 不规则 絮状 无 扁平 白色 不透明松树下BN18 圆形 絮状 无 扁平 乳白色 不透明BN19 近圆形 不整齐 无 扁平 乳白色 不透明BN20 圆形 整齐 无 略隆起 白色 向外渐透明BN21 圆形 假根状 无 略隆起 白色 不透明臭椿树下BN22 近圆形 不整齐 无 扁平 乳白色 不透明BN23 圆形 整齐 有 略隆起 白色 不透明BN24 不规则 絮状 无 扁平 白色 不透明BN25 圆形 整齐 无 扁平 白色 不透明盐肤木下BN26 圆形 整齐 无 扁平 黄白色 不透明BN27 不规则 假根状 无 扁平 白色 向外渐透明BN28 近圆形 整齐 有 略隆起 黄白色 不透明BN29 不规则 假根状 有 扁平 乳白色 半透明BN30 圆形 整齐 无 扁平 黄白色 不透明

2.3 拮抗菌发酵液对病原真菌的抑制作用

采用环柱测定法，测定了BN8、BN10、BN22和BN29对7种植物病原真菌抑制作用。图2显示了 4株芽孢杆菌发酵液对植物病原真菌的抑制效果，图3显示了发酵液对病原真菌的抑制率。

图2 4株芽孢杆菌发酵液对7种植物病原真菌抑制作用G-苹果轮纹病菌，H-小麦赤霉病菌，I-葡萄黒痘病菌，J-西瓜枯萎病菌，K-棉花枯萎病菌，L-水稻纹枯病菌，M-黄瓜枯萎病菌。4株芽孢杆菌位置如图G所示：上-BN8，下-BN22，左-BN29，右-BN10，中间-对照

从图2可以明显地看出，4株拮抗菌株发酵液对所供试的7种植物病原真菌均具有很高的抑制作用，而且抑制的边缘菌丝量较少。其中较为明显的是4株菌株发酵液对西瓜枯萎病菌抑制效果最强，菌丝几乎不生长，其次为苹果轮纹病菌和水稻纹枯病菌，并可影响小麦赤霉病菌色素的产生。其中BN29对苹果轮纹病菌、葡萄黒痘病菌、棉花枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制效果明显高于其他3株菌株。 图3 4株芽孢杆菌发酵液对7种植物病原真菌的抑菌率

从图3可以看出，4株拮抗菌株发酵液对所供试的7种植物病原真菌的抑制率均

在70%～90%之间，其中对苹果轮纹病菌、西瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌的抑制效果最高，高达 90%；对小麦赤霉病菌的抑制效果相对较弱；4株芽孢杆菌发酵液均对葡萄黒痘病菌、棉花枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌抑制相当。由于采用的是芽孢杆菌发酵液，可以推断出4株芽孢杆菌发酵液皆具有良好的水溶性和扩展性。 2.4 拮抗菌株发酵液对植物病原真菌形态影响

选用受BN8菌株发酵液影响的真菌菌丝，在显微镜下进行观察，结果如图4。 图4 BN8菌株发酵液对病菌菌丝形态的影响N-黄瓜枯萎病原真菌，N1-正常菌丝，N2-受抑制菌丝；O-水稻纹枯病菌，O1-正常菌丝，O2-受抑制菌丝；P-西瓜枯萎病菌，P1-正常菌丝，P2-受抑制菌丝

从图4中可以看出，BN8所产生的抗菌物质对某些病原真菌的生长形态具有一定的影响。其中抗菌物质使黄瓜枯萎病菌的菌丝发生褐化，并使其扭曲变形，可以刺激黄瓜枯萎病菌产生大量的小孢子，但是是否抑制孢子的萌发，还有待于进一步的验证；可以使水稻纹枯病菌的菌丝膨大，细胞壁变透明，菌丝末端变细；抗菌物质使西瓜枯萎病菌菌丝变细，并使部分菌丝末端钝圆。可以看出 BN8菌株发酵液影响病菌代谢合成和形态变化，为进一步研究其拮抗机理提供了依据。 2.5 生化测定结果及初步鉴定

从表2可以看出，BN8为革兰氏阳性菌，其余3株为革兰氏阴性菌。且4株芽孢杆菌都可使淀粉发生不同程度的水解，说明都可产生淀粉酶，根据水解程度，可以确定产酶活力大小为 BN22＞N29＞BN8＞BN10；4株拮抗菌株都可使明胶液化，说明都可产生明胶酶水解明胶；同时，通过接触酶试验说明，4株芽孢杆菌都可以产生过氧化氢酶。综合菌株的个体形态、菌落特征及部分生化测定，结合相关文献，初步确定BN8为一株枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)，其它3株拮抗菌有待于进一步鉴定。

表2 4株芽孢杆菌生理生化特征注：“＋”表示阳性，“-”表示阴性。菌株 革

兰氏染色 芽孢形状 明胶液化 淀粉水解 接触酶BN8 + 椭圆 + + +BN10 - 椭圆 + + +BN22 - 杆状 + + +BN29 - 梭状 + + + 3 结论与讨论

本试验从不同环境中分离得到了30株芽孢杆菌，通过测定发现其中4株对病原真菌皆具有较好的拮抗作用且具有广谱性，其中BN8和BN29的抑制效果相对较好，菌株发酵液可影响丝状真菌菌丝的生长和形态，并初步鉴定BN8为枯草芽孢杆菌。 利用生防菌防治植物病害主要有两种情况，一是直接利用拮抗菌株进行防治，国内外已有许多成功的例子，如美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可[9]，辛玉成等利用枯草芽孢杆菌XM16菌株制剂防治苹果霉心病，防效显著[10]；二是从芽孢杆菌中分离抗菌物质，寻求农药合成先导化合物，此为现在的研究热点。本试验所用样品均来自土壤，所分离到的芽孢杆菌易于在土壤中定殖，具有开发成菌体制剂的潜力。通过发酵液抑菌试验证明，菌株发酵液中存在较高的抗菌活性物质，可进一步进行盆栽活体试验、作用机制等方面的研究，亦可进行活性成分分离鉴定方面的工作，为进一步开发生物农药提供有益菌源和基础依据。 参考文献

【相关文献】

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[2]程洪斌,刘晓桥,陈红漫.枯草芽孢杆菌防治植物真菌病害研究进展 [J].上海农业学报,2006,22 (1)：109-112.

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[4]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验 (第三版) [M].北京：高等教育出版社,1996：214-217.

[5]张小舟,徐剑宏,李顺鹏.植病生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定 [J].土壤,2005,37 (1)：85-88. [6]方中达.植病研究法 (第三版)[M].北京：中国农业出版社,1998：248-249. [7]戈登RE,海恩斯WC,帕格CHN.芽孢杆菌属 [M].北京：农业出版社,1983：6-108. [8]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册 [M].北京：科学出版社,2001：59-63. [9]Office of Pesticide Program：biopesticide [R/OL].2001.http：//www.epa.gov/pesticides/biopesticides.

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