一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112379078 A(43)申请公布日 2021.02.19

(21)申请号 202011137427.8(22)申请日 2020.10.22

(71)申请人 广东省科学院生态环境与土壤研究

所

地址 510650 广东省广州市天源路808号(72)发明人 蒋新宇　程炯　刘平　刘晓南　(74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有

限公司 44205

代理人 胡辉(51)Int.Cl.

G01N 33/24(2006.01)G01N 27/62(2021.01)G01N 1/34(2006.01)G01N 1/44(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页

()发明名称

一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法(57)摘要

本发明公开了一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法，所述方法包括如下步骤：将土壤样品分成两组，其中，第一组样品经过氯仿熏蒸处理后用硫酸钾溶液萃取后得滤液A，第二组样品不经过熏蒸处理直接用硫酸钾溶液萃取后得滤液B；测定滤液A和滤液B的总碳含量，并分别将剩余的部分密封后冷冻干燥得粉末A和粉末B，分别对粉末A和粉末B进行13C含量测定进而计算出土壤样品的微生物13C含量。此方法简单方便，还可以提高单位体积样品内的碳同位素含量，可以检测浓度较低的样品，灵敏度高，最低可检测的样品最低浓度为0.5mg/L，而且成本更低。CN 112379078 ACN 112379078 A

权　利　要　求　书

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1.一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法，包括以下步骤：S1：将土壤样品分成两组，其中，第一组样品经过氯仿熏蒸处理后用硫酸钾溶液萃取后得滤液A，第二组样品用硫酸钾溶液萃取后得滤液B；

S2：取少量测定滤液A和滤液B的总碳含量，并分别将剩余的部分密封后冷冻干燥得粉末A和粉末B，冷冻保存；

S3：分别对粉末A和粉末B进行13C含量测定，进而计算土壤微生物碳同位素含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中计算土壤微生物碳同位素含量的具体方法为：通过

计算土壤样品的微生物13C含量；

131313其中，C-MBC为土壤微生物碳同位素含量，δCf和δCnf分别为粉末A和粉末B的13C丰度，Cf和Cnf分别为滤液A和滤液B的总碳含量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述土壤样品为过4mm筛所得。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述氯仿熏蒸处理具体为将样品置于氯仿环境下密闭培养20～28h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述硫酸钾浓度为0.4～0.6mol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述第一组样品与硫酸钾溶液的土水比为1:(4～6)。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述第二组样品与硫酸钾溶液的土水比为1:(4～6)。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述萃取的条件为：22～28℃、170～230rpm，1.5～2.5h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述冷冻干燥的条件为：温度为-70～-80℃，时间为68～80h。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述保存的温度为-18～-22℃。

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一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法

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技术领域

[0001]本发明属于土壤微生物碳的测定技术领域，更具体地，涉及一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法。

背景技术

[0002]全球变化研究中，碳循环处于核心地位。过去200年中，由于大气CO2浓度的不断上升，碳循环和温室气体问题越来越受到重视。全球碳循环研究的重点在于查明碳源、碳汇，并进行定量。土壤碳循环是全球碳循环的重要一环，土壤的全球平均厚度只有3m，但土壤中蕴含的碳含量是大气碳含量的2倍以上。因此，土壤碳含量的变化会对大气CO2浓度和全球碳循环造成显著影响。土壤微生物对于土壤元素循环起着重要作用，大量外源有机碳通过微生物作用进入土壤环境，或者以微生物残留物的形式在土壤环境中长期持留。[0003]当前在土壤碳循环研究领域，借助同位素示踪技术对土壤碳的环境行为进行示踪研究，并对土壤碳在不同碳库中进行定量，是相关研究的重点。其中，土壤微生物的碳同位素测定，需要借助高精度仪器，技术较复杂，单次测定费用较为昂贵。土壤微生物碳提取主要通过“氯仿熏蒸—K2SO4萃取”实现，由于萃取后所得为液体样品，进样浓度常常达不到要求而导致检测结果误差大，甚至检测不到结果。同时，针对液体的同位素测定费用较高，单样的测试费用通常在1000元左右，这极大的了土壤微生物碳同位素的分析测定。发明内容

[0004]本发明的目的在于提供一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法。[0005]本发明所采取的技术方案是：

[0006]本发明提供了一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法，包括以下步骤：[0007]S1：将土壤样品分成两组，其中，第一组样品经过氯仿熏蒸处理后用硫酸钾溶液萃取后得滤液A，第二组样品不经过熏蒸处理直接用硫酸钾溶液萃取后得滤液B；[0008]S2：测定滤液A和滤液B的总碳含量，并分别将剩余的部分密封后冷冻干燥得粉末A和粉末B，冷冻保存；[0009]S3：分别对粉末A和粉末B进行13C含量测定，进而计算土壤微生物碳同位素含量。[0010]根据本发明所述的方法，步骤S3中计算土壤微生物碳同位素含量的具体方法为：通过

[0011]

计算土壤样品的微生物13C含量；

131313

其中，C-MBC为土壤微生物碳同位素含量，δCf和δCnf分别为粉末A和粉末B的

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C丰度，Cf和Cnf分别为滤液A和滤液B的总碳含量。[0012]根据本发明所述的方法，步骤S1中所述土壤样品为过4mm筛所得。[0013]根据本发明所述的方法，步骤S1中所述氯仿熏蒸处理具体为将样品置于氯仿环境下密闭培养20～28h。[0014]优选地，根据本发明所述的方法，步骤S1中所述氯仿熏蒸处理具体为将样品置于

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氯仿环境下密闭培养24h。

[0015]根据本发明所述的方法，步骤S1中所述硫酸钾浓度为0.4～0.6mol/L。[0016]优选地，根据本发明所述的方法，步骤S1中所述硫酸钾浓度为0.5mol/L。[0017]根据本发明所述的方法，步骤S1中第一组样品与硫酸钾溶液的土水比为1:(4～6)。

[0018]优选地，根据本发明所述的方法，步骤S1中第一组样品与硫酸钾溶液的土水比为1:5。

[0019]根据本发明所述的方法，步骤S1中第二组样品与硫酸钾溶液的土水比为1:(4～6)。

[0020]优选地，根据本发明所述的方法，步骤S1中第二组样品与硫酸钾溶液的土水比为1:5。

[0021]根据本发明所述的方法，步骤S1中所述萃取的条件为：22～28℃、170～230rpm，1.5～2.5h。

[0022]根据本发明所述的方法，步骤S1中所述萃取的条件为25℃、200rpm，2h。[0023]根据本发明所述的方法，步骤S2中所述冷冻干燥的条件为：温度为-70～-80℃，时间为68～80h。[0024]优选地，根据本发明所述的方法，步骤S2中所述冷冻干燥的条件为：温度为-80℃，时间为72h。

[0025]根据本发明所述的方法，步骤S2中所述保存的温度为-18～-22℃。[0026]优选地，根据本发明所述的方法，步骤S2中所述保存的温度为-20℃。[0027]根据本发明所述的方法，步骤S2中所述总碳含量是通过TOC分析仪测定。[0028]根据本发明所述的方法，步骤S3中所述13C含量测定具体为将粉末放入测试用锡杯，将锡杯包好后放入同位素质谱仪测定。[0029]本发明的有益效果是：

[0030]本发明通过冷冻干燥可以极大的缩小待测样品的体积，与溶液体积相比，冷冻所得粉末的体积仅为1/5左右，这可以有效提高单位体积样品内的碳同位素含量，从而使得进样浓度高于仪器检测限，可以检测较低浓度的样品，方便快捷，灵敏度高，使用该方法可检测的样品最低浓度为0.5mg/L。

具体实施方式

[0031]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。[0032]实施例1

[0033]一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法，包括以下步骤：[0034]S1：从广东省广州市增城区洋田村实验基地田块中采集0～15cm土壤样品，去除石头和植物根系后，风干过4mm筛备用。同时设置熏蒸和不熏蒸处理，单个平行样加入10g土壤样品(以干重计)。熏蒸样品置于氯仿环境下，密闭培养24h。随后用50mL0.5mol/L的K2SO4溶液萃取土壤中的溶解性有机碳，其中萃取的条件为：温度为25℃、转速为200rpm，时间为2h。不熏蒸处理样品直接用50mL0.5mol/L的K2SO4溶液萃取。每个处理均有3个平行。[0035]S2：萃取后所得滤液，取10mL使用TOC分析仪测定其中的总碳含量。

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S3：取50mL置于塑料离心管内，使用密封条将管口密封，并用细针在管口封条上扎

上3～4个小孔。立即使用冷冻干燥机进行脱水处理(-80℃，72h)。脱水处理后立即将所得粉末置于密封样品管内，-20℃冷冻保存，备测。测试时，取出0.8～1.2mg粉末，加入测试用锡杯，将锡杯包成实心球体，放入同位素质谱仪测定样本中的13C含量。

S4：通过下式计算土壤样品的微生物13C含量，

[0037]

131313其中，C-MBC为土壤微生物碳同位素含量，δCf和δCnf分别为熏蒸和不熏蒸处理的冷冻干燥固体样品13C丰度，Cf和Cnf分别为熏蒸和不熏蒸处理的滤液总碳含量。[0038]采集相同的土壤样品，将步骤S1～S4重复进行3次，通过分析不同批次的数据，测试该检测方法的稳定性。[0039]具体结果见表1。

[0040]表1洋田村实验基地土壤微生物13C含量检测结果

[0041]

实施例2

[0043]一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法，包括以下步骤：[0044]S1：从广东省湛江市雷州东里镇六格村实验基地田块中采集0～15cm土壤样品，去除石头和植物根系后，风干过4mm筛备用。同时设置熏蒸和不熏蒸处理，单个平行样加入10g土壤样品(以干重计)。熏蒸样品置于氯仿环境下，密闭培养24h。随后用50mL 0.5mol/L的K2SO4溶液萃取土壤中的溶解性有机碳，其中萃取的条件为：温度为25℃、转速为200rpm，时间为2h。不熏蒸处理样品直接用50mL 0.5mol/L的K2SO4溶液萃取。每个处理均有3个平行。[0045]S2：萃取后所得滤液，取10mL使用TOC分析仪测定其中的总碳含量。[0046]S3：取50mL置于塑料离心管内，使用密封条将管口密封，并用细针在管口封条上扎上3～4个小孔。立即使用冷冻干燥机进行脱水处理(-80℃，72h)。脱水处理后立即将所得粉末置于密封样品管内，-20℃冷冻保存，备测。测试时，取出0.8～1.2mg粉末，加入测试用锡杯，将锡杯包成实心球体，放入同位素质谱仪测定样本中的13C含量。

[0047]

[0042]

S4：通过下式计算土壤样品的微生物13C含量，

131313其中，C-MBC为土壤微生物碳同位素含量，δCf和δCnf分别为熏蒸和不熏蒸处理的冷冻干燥固体样品13C丰度，Cf和Cnf分别为熏蒸和不熏蒸处理的滤液总碳含量。[0048]采集相同的土壤样品，将步骤S1～S4重复进行3次，通过分析不同批次的数据，测试该检测方法的稳定性。[0049]具体结果见表2。

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表2六格村实验基地土壤微生物13C含量检测结果

[0051]

对比实施例1

[0053]一种测定土壤微生物碳同位素含量的方法，包括以下步骤：[00]1：从广东省广州市增城区洋田村实验基地田块中采集0～15cm土壤样品，去除石头和植物根系后，风干过4mm筛备用。同时设置熏蒸和不熏蒸处理，单个平行样加入10g土壤样品(以干重计)。熏蒸样品置于氯仿环境下，密闭培养24h。随后用50mL 0.5mol/L的K2SO4溶液萃取土壤中的溶解性有机碳，其中萃取的条件为：温度为25℃、转速为200rpm，时间为2h。不熏蒸处理样品直接用50mL 0.5mol/L的K2SO4溶液萃取。每个处理均有3个平行。[0055]2：萃取后所得滤液，取10mL使用TOC分析仪测定其中的总碳含量。[0056]3：剩余滤液，取50mL直接用TOC-PDZ同位素质谱仪进行液体碳同位素测定。[0057]采集相同的土壤样品，将步骤1～3重复进行3次，通过分析不同批次的数据，测试该检测方法的稳定性。[0058]具体结果见表3。

[0059]表3洋田村实验基地土壤微生物13C含量检测结果

[0052]

[0060]

对比实施例2

[0062]1：从广东省湛江市雷州东里镇六格村实验基地田块中采集0～15cm土壤样品，去除石头和植物根系后，风干过4mm筛备用。同时设置熏蒸和不熏蒸处理，单个平行样加入10g土壤样品(以干重计)。熏蒸样品置于氯仿环境下，密闭培养24h。随后用50mL 0.5mol/L的K2SO4溶液萃取土壤中的溶解性有机碳，其中萃取的条件为：温度为25℃、转速为200rpm，时间为2h。不熏蒸处理样品直接用50mL 0.5mol/L的K2SO4溶液萃取。每个处理均有3个平行。[0063]2：萃取后所得滤液，取10mL使用TOC分析仪测定其中的总碳含量。[00]3：剩余滤液，取50mL直接用TOC-PDZ同位素质谱仪进行液体碳同位素测定。

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采集相同的土壤样品，将步骤1～3重复进行3次，通过分析不同批次的数据，测试

该检测方法的稳定性。[0066]具体结果见表4。

[0067]表4六格村实验基地土壤微生物13C含量检测结果

[0068]

实施例3灵敏度检测

[0070]1：以商用葡萄糖为碳源(13C含量为1.0977±0.0011‰)，分别设置0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30mg/L(以碳计，溶液中的碳含量)多个处理，每个处理设置3个平行样。按上述比例将葡萄糖溶于50mL 0.5mol/L的K2SO4溶液中，模拟萃取后的溶液，以mg/L(以碳计)作为背景值对照。[0071]2：将上述所得溶液置于塑料离心管内，使用密封条将管口密封，并用细针在管口封条上扎上3～4个小孔。立即使用冷冻干燥机进行脱水处理(-80℃，72h)。脱水处理后立即将所得粉末置于密封样品管内，-20℃冷冻保存，备测。测试时，取出0.8～1.2mg粉末，加入测试用锡杯，将锡杯包成实心球体，放入同位素质谱仪测定样本中的13C含量。[0072]3：具体结果见表5。

[0073]表5不同溶液碳含量下的13C含量检出值

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结果显示：当溶液碳含量大于0.5mg/L时，可获得较为可靠的数据。当溶液碳含量

低于0.5mg/L，较难获得有效数据，这与检查仪器密切相关，故将检出限设置为0.5mg/L。[0076]实施例4准确度分析[0077](1)对实施例1和对比实施例1的测定结果进行差异性分析，参照ANOVA统计分析方法，具体结果见表6，P>0.05。说明两个结果在统计上不存在显著差异，可判定为结果一致。核算分析测定费用，冷冻干燥方法的测试费用仅为液体直接测定方法的23％。[0078]表6实施例1和对比实施例1的测定结果的差异性分析

[0079]

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(2)对实施例2和对比实施例2的测定结果进行差异性分析，参照ANOVA统计分析方

法，具体结果见表7，P>0.05。说明两个结果在统计上不存在显著差异，可判定为结果一致。核算分析测定费用，冷冻干燥方法的测试费用仅为液体直接测定方法的23％。[0082]表7实施例2和对比实施例2的测定结果的差异性分析

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[0083]

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本

发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

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