固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 106222124 A(43)申请公布日 2016.12.14

(21)申请号 201610622349.8(22)申请日 2016.07.29

(71)申请人 玉林师范学院

地址 537000 广西壮族自治区玉林市教育

路299号(72)发明人 周盛　王小敏　

(74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理

有限公司 11340

代理人 但玉梅(51)Int.Cl.

C12N 1/38(2006.01)C12N 1/36(2006.01)C12N 1/02(2006.01)C12N 1/14(2006.01)C12N 1/20(2006.01)

权利要求书2页 说明书7页

C12N 1/12(2006.01)C12R 1/(2006.01)

CN 106222124 A()发明名称

固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法(57)摘要

本发明提供固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法，属于微生物技术领域。筛选方法包括以下步骤：(1)兼性固氮碳培养基的配制；(2)微生物的选择；(3)好氧驯化富集；(4)

(5)梯度平板分离；利用无氮碳培厌氧驯化富集；

养基可以有效地筛选出兼性固氮碳的微生物，同时利用好氧和厌氧驯化富集处理，可以进一步使所筛选出来的兼性固氮碳微生物也具有兼性厌氧性，使筛选出的微生物能适应富氧或缺氧等恶劣条件，提高兼性固氮碳微生物的适应性，并利用电子传递体进行信息交流，促进微生物的呼吸和生长，微量元素的添加也大幅缩短了筛选周期，本发明的筛选方法不仅降低固氮碳成本，同时降低温室气体的排放，以达变废为宝，循环利用。

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权　利　要　求　书

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1.固碳氮微生物的培养基，其特征在于：所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.0～1.5g、K2HPO4 2.0～2.5g、MgSO4·7H2O 0.2～0.3g、NaCl 20～30g、CaCl20.01～0.02g、FeSO4 0.01～0.02g，电子传递物质2.0～3.0g、微量元素混合液2～3ml；

其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.68～1.70mg、H3BO3 0.4～0.5mg、ZnSO4·7H2O 1.0～1.5mg、MnSO4·5H2O 1.0～1.5mg、CuSO4·5H2O 7.0～8.0mg、CoCl2·6H2O 1.0～1.5mg、NiSO4·7H2O 1.0～1.5mg。

2.根据权利要求1所述固碳氮微生物的培养基，其特征在于：所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.1～1.4g、K2HPO4 2.1～2.4g、MgSO4·7H2O 0.24～0.28g、NaCl 22～28g、CaCl2 0.012～0.018g、FeSO4 0.012～0.018g，电子传递物质2.2～2.8g、微量元素混合液2.2～2.8ml；

其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.685～1.695mg、H3BO3 0.42～0.48mg、ZnSO4·7H2O 1.1～1.4mg、MnSO4·5H2O 1.1～1.4mg、CuSO4·5H2O 7.2～7.8mg、CoCl2·6H2O 1.1～1.4mg、NiSO4·7H2O 1.1～1.4mg。

3.根据权利要求1所述固碳氮微生物的培养基，其特征在于：所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.25g、K2HPO4 2.3g、MgSO4·7H2O 0.26g、NaCl 25g、CaCl20.015g、FeSO4 0.015g，电子传递物质2.5g、微量元素混合液2.5ml；

 其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.69mg、H3BO3 0.45mg、ZnSO4·7H2O

 1.3mg。CoCl2·6H2O 1.25mg、NiSO4·7H2O 1.3mg、CuSO4·5H2O7.5mg、1.3mg、MnSO4·5H2O

4.根据权利要求1～3任意一项所述一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)微生物的选择：菌类采样方法：采样为离地表大于15cm的土壤3份，将三份土壤磨碎混匀后称取1g加入至装有玻璃珠的三角瓶中，并在其中注入9～10ml无菌水，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，充分混合配置成土壤悬浮液；

(2)好氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气比例N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1用针筒打入相应量的N2、CO2和O2，用封口膜封口；将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中,以便排气；后将步骤(2)中的土壤悬浮液加入到装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，2～3d为一个富集周期，每个周期结束后重新充入混合气，比例N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1，重复富集过程共2～3次得到菌液；

(3)厌氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，将有氧气氛混合气即空气∶CO2＝9∶1的气体用针筒打入，用封口膜封口，将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气，将步骤(3)的菌液转接到新的装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，2～3d为一个富集周期，培养一个周期后，再将无氧气氛混合气N2∶CO2＝9∶1用针筒打入血清瓶中，再以2～3d为一个富集周期，培养一个周期后，再在有氧气氛和无氧气氛条件下重复5～6个周期，最后得到目的菌液；

(4)梯度平板分离：采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，运用涂布平板培养法，先将无碳氮培养基倒入无菌平板中，待凝固后编

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号10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每一号码设置三个重复，分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中，用涂布棒涂布于无碳氮培养基平板，将涂布好的平板平放于桌上静置5～10min，待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取形状不同的单菌落划线培养，其中单菌落为所筛选的微生物。

5.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中的采样土壤为花生根际处土壤、豆类植物根际处土壤中的一种或两种的混合。

6.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：所述电子传递物质为硫化钠或硫代硫酸钠中的一种或两种的混合物。

7.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：所述无碳氮培养基的pH值为4.5～6.8。

8.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：步骤(4)中对于耐CO2、N2的菌还需用胶塞试管代替培养基平板进行筛选。

9.根据权利要求1所述的一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，其特征在于：所述方法还可以用于固氮碳藻类微生物的筛选。

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固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法

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【技术领域】

[0001]本发明涉及微生物技术领域，具体涉及固碳氮微生物的培养基及固碳氮微生物的筛选方法。

【背景技术】[0002]目前，公知的微生物固碳菌、微生物固氮菌分别只能固定CO2和N2，在学术上和传统理论上固定N2的固氮菌和固定CO2的固碳菌分别早已被研究和发现。现有大量研究表明大自然中尤其是土壤中存在很多具有固碳功能的微生物，从微生物进化理论而言，微生物对环境的适应性强、变异快、代谢途径和营养类型多样化，同时固定N2和CO2的微生物的存在不无可能，尤其是分布在豆科植物(不施氮肥为最佳选择)根部土壤中(当然也不排除别的生境可能也存在这类微生物)很多固氮菌中极有可能存在某些能同时具有固碳功能的微生物。另外，分布在水体尤其是深海中的一些固碳菌也极有可能存在某些能同时具有固氮功能的微生物。

[0003]《环境科学学报》第33卷第4期中的公开论文《一种能同时固定CO2和N2的微生物--兼性固CO2、N2菌的分离鉴定及其验证实验》，该论文用固氮或固碳的培养基中优化出兼性固氮碳微生物培养基来筛选兼性固氮碳细菌，但该电子传递中没有电子传递体，不易促进微生物的呼吸和生长，且该论文的兼性无氮碳培养基虽然能筛选细菌，也能用于筛选真菌和一些藻类微生物，但适应性不强，且在该培养基下细菌、真菌和藻类微生物生长慢，筛选周期长，且培养过程中的细菌、真菌和藻类微生物呼吸链易造成问题导致死亡。【发明内容】

[0004]本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供提供一种固碳氮微生物的培养基及兼性固碳氮微生物的筛选方法，不仅可以筛选兼性固氮碳的细菌，而且可以筛选真菌和部分藻类微生物，同时本发明的兼性无氮碳培养基中增加了电子传递体还能促进微生物的呼吸和生长，微量元素的配制和添加也能进一步加速细菌、真菌和藻类微生物的生长，进一步提高了筛选的效率。[0005]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：[0006]固碳氮微生物的培养基，所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.0～1.5g、K2HPO4 2.0～2.5g、MgSO4·7H2O 0.2～0.3g、NaCl 20～30g、CaCl2 0.01～0.02g、FeSO4 0.01～0.02g，电子传递物质2.0～3.0g、微量元素混合液2～3ml；[0007]其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.68～1.70mg、H3BO3 0.4～0.5mg、ZnSO4·7H2O 1.0～1.5mg、MnSO4·5H2O 1.0～1.5mg、CuSO4·5H2O 7.0～8.0mg、CoCl2·6H2O 1.0～1.5mg、NiSO4·7H2O 1.0～1.5mg。[0008]进一步地所述固碳氮微生物的培养基，所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.1～1.4g、K2HPO4 2.1～2.4g、MgSO4·7H2O 0.24～0.28g、NaCl 22～28g、CaCl2 0.012～0.018g、FeSO4 0.012～0.018g，电子传递物质2.2～2.8g、微量元素混合液2.2～2.8ml；

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其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.685～1.695mg、H3BO3 0.42～

0.48mg、ZnSO4·7H2O 1.1～1.4mg、MnSO4·5H2O 1.1～1.4mg、CuSO4·5H2O 7.2～7.8mg、CoCl2·6H2O 1.1～1.4mg、NiSO4·7H2O 1.1～1.4mg。[0010]根据权利要求1所述固碳氮微生物的培养基，所述培养基的组成及重量为：KH2PO4 1.25g、K2HPO4 2.3g、MgSO4·7H2O 0.26g、NaCl 25g、CaCl20.015g、FeSO4 0.015g，电子传递物质2.5g、微量元素混合液2.5ml；

[0011]其中微量元素混合液中的溶质为：Na2MoO4·2H2O 1.69mg、H3BO3 0.45mg、ZnSO4·7H2O 1.3mg、MnSO4·5H2O 1.3mg、CuSO4·5H2O7.5mg、CoCl2·6H2O 1.25mg、NiSO4·7H2O 1.3mg。

[0012]根据以上培养基的配方，所述一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，包括以下步骤：[0013](1)微生物的选择：[0014]菌类采样方法：采样为离地表大于15cm的土壤3份，将三份土壤磨碎混匀后称取1g加入至装有玻璃珠的三角瓶中，并在其中注入9～10ml无菌水，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，充分混合配置成土壤悬浮液；[0015](2)好氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气比例N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1用针筒打入相应量的N2、CO2和O2，用封口膜封口；将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中,以便排气；后将步骤(2)中的土壤悬浮液加入到装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，2～3d为一个富集周期，每个周期结束后重新充入混合气，比例N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1，重复富集过程共2～3次得到菌液；[0016](5)厌氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，将有氧气氛混合气即空气∶CO2＝9∶1的气体用针筒打入，用封口膜封口，将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气，将步骤(3)的菌液转接到新的装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28～30℃，120～150r/min振荡20～30min，2～3d为一个富集周期，培养一个周期后，再将无氧气氛混合气N2∶CO2＝9∶1用针筒打入血清瓶中，再以2～3d为一个富集周期，培养一个周期后，再在有氧气氛和无氧气氛条件下重复5～6个周期，最后得到目的菌液；[0017](6)梯度平板分离：采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，运用涂布平板培养法，先将无碳氮培养基倒入无菌平板中，待凝固后编号10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每一号码设置三个重复，分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中，用涂布棒涂布于无碳氮培养基平板，将涂布好的平板平放于桌上静置5～10min，待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取形状不同的单菌落划线培养，其中单菌落为所筛选的微生物。[0018]进一步地，步骤(2)中的采样土壤为花生根际处土壤、豆类植物根际处土壤中的一种或两种的混合，很多研究表明大自然中尤其是土壤中很多微生物都有固碳功能，但不一定有固氮功能。固氮菌大多分布在豆科植物(不施氮肥为最佳选择)根部土壤中，这部分的固氮菌极有可能有些会同时具有固碳功能。[0019]进一步地，所述电子传递物质为硫化钠或硫代硫酸钠中的一种或两种的混合物；因兼性固碳氮菌无碳氮培养基无电子传递体故加电子传递体，微生物利用游离的硫离子作

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为电子传递体进行信息交流，并促进微生物的呼吸和生长。[0020]进一步地，所述兼性固碳氮微生物无碳氮培养基是在固碳菌培养基和固氮菌培养基的基础上优化组合而来的，不仅可以筛选兼性固氮碳的细菌，而且可以筛选真菌和部分藻类微生物。

[0021]进一步地，所述培养基的pH值为4.5～6.8，不仅有利于细菌，也有利于真菌和藻类微生物的生长，而且适应更多种类的细菌、真菌和藻类的生长。[0022]进一步地，步骤(5)中对于耐CO2、N2的菌还需用胶塞试管代替培养基平板进行筛选。

[0023]进一步地，所述方法还可以用于从水体中筛选出固氮碳藻类微生物。[0024]综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：[0025](1)本发明使用无氮、碳源的培养基不仅可以筛选兼性固氮碳细菌，而且可以进一步筛选出兼性固氮碳的真菌和藻类微生物，其将对传统的微生物学的营养和代谢理论作重要补充，而兼性固CO2、N2菌在固碳时不需外加碳源，从而降低固碳成本，同时降低温室气体的排放，其将为实现CO2微生物固定回收与资源化提供一条重要的有效途径，以达变废为宝，循环利用。

[0026](2)本发明中使用硫化钠或硫代硫酸钠作为电子传递体，微生物利用游离的硫离子作为电子传递体进行信息交流，并促进微生物的呼吸和生长。

[0027](3)本发明中应用好氧驯化富集和厌氧驯化富集进一步筛选兼性固氮碳微生物，可以进一步使所筛选出来的兼性固氮碳微生物也具有兼性厌氧性，使筛选出的微生物能适应富氧或缺氧等恶劣条件，提高兼性固氮碳微生物的适应性。

[0028](4)本发明使用的微量元素可以有效提高微生物的生长速度，使富集和筛选周期大幅缩短，不添加本发明微量元素筛选前生长周期需至少72h，使用本发明微量元素后，生长周期缩短至48h，提高了筛选效率。

[0029](5)本发明无碳氮培养基pH值在4.5～6.8的范围，适用于更多的细菌、真菌及藻类的存活和筛选。

【具体实施方式】

[0030]以下通过具体实施例和验证效果对本发明作进一步详述。[0031]实施例1

[0032]一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，包括以下步骤：

[0033](1)兼性固碳氮微生物无碳氮培养基的配制组份及用量：[0034]KH2PO4 1.0g、K2HPO4 2.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 20g、CaCl2 0.01g、FeSO4 0.01g、电子传递物质2.0g、微量元素混合液2ml，加入蒸馏水至1000ml，121℃灭菌20min，pH值4.5；

[0035]其中微量元素混合液(mg/L)：Na2MoO4·2H2O 1.68mg、H3BO3 0.4mg、ZnSO4·7H2O 1.0mg、MnSO4·5H2O 1.0mg、CuSO4·5H2O 7.0mg、CoCl2·6H2O 1.0mg、NiSO4·7H2O 1.0mg；[0036](2)微生物的选择：[0037]菌类采样方法：采样为花生根际处离地表大于15cm的土壤3份，将三份土壤磨碎混匀后称取1g加入至装有玻璃珠的三角瓶中，并在其中注入9ml无菌水，然后置于摇床28～30

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℃，120r/min振荡20min，充分混合配置成土壤悬浮液；[0038](3)好氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气比例(N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1)用针筒打入相应量的N2、CO2和O2，用封口膜封口；将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中,以便排气；后将步骤(2)中的样品稀释液加入到装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28℃，120r/min振荡20min，2d为一个富集周期，每个周期结束后重新充气，重复富集过程共2次得到目的菌液；[0039](4)厌氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按有氧气氛的混合气比例空气∶CO2＝9∶1的条件下，用针筒打入，用封口膜封口，将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气，将步骤(3)的菌液转接到新的装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床28℃，120r/min振荡20min，2d为一个富集周期，培养一个周期后，再将无氧气氛混合气N2∶CO2＝9∶1用针筒打入血清瓶中，再以2d为一个富集周期，培养一个周期后，再在有氧气氛和无氧气氛条件下重复5个周期，最后得到目的菌液；

[0040](5)梯度平板分离：采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，运用涂布平板培养法，先将无碳氮培养基倒入无菌平板中，待凝固后编号10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每一号码设置三个重复，分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中，用涂布棒涂布于无碳氮培养基平板，将涂布好的平板平放于桌上静置5～10min，待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取形状不同的单菌落划线培养，其中单菌落为所筛选的微生物。

[0041]很多研究表明大自然中尤其是土壤中很多微生物都有固碳功能，但不一定有固氮功能。固氮菌大多分布在豆科植物(不施氮肥为最佳选择)根部土壤中，这部分的固氮菌极有可能有些会同时具有固碳功能；且使用硫化钠作为电子传递物质，微生物利用游离的硫离子作为电子传递体进行信息交流，并促进微生物的呼吸和生长；另外兼性固碳氮微生物无碳氮培养基是在固碳菌培养基和固氮菌培养基的基础上优化组合而来的，不仅可以筛选兼性固氮碳的细菌，而且可以筛选真菌和部分藻类微生物；步骤(4)中好氧及厌氧的气氛组成分别为：好氧气氛为空气∶CO2＝9∶1，厌氧气氛为N2∶CO2＝9∶1，可以对兼性固氮碳微生物进行准确的筛选，且所筛选的微生物也是兼性厌氧微生物；同时，步骤(5)中对于耐CO2、N2的菌还需用胶塞试管代替培养基平板进行筛选，该方法还可以用于从水体中筛选出固氮碳藻类微生物。

[0042]实施例2

[0043]一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，包括以下步骤：

[0044](1)兼性固碳氮微生物无碳氮培养基的配制组份及用量：[0045]KH2PO4 1.5g、K2HPO4 2.5g、MgSO4·7H2O 0.3g、NaCl 30g、CaCl2 0.02g、FeSO4 0.02g、电子传递物质3.0g、微量元素混合液3ml，加入蒸馏水至1000ml，125℃灭菌25min，pH值5.5；

[0046]其中微量元素混合液(mg/L)：Na2MoO4·2H2O 1.70mg、H3BO3 0.5mg、ZnSO4·7H2O 1.5mg、MnSO4·5H2O 1.5mg、CuSO4·5H2O 8.0mg、CoCl2·6H2O 1.5mg、NiSO4·7H2O 1.5mg；[0047](2)微生物的选择：[0048]菌类采样方法：采样为豌豆根际处离地表大于15cm的土壤3份，将三份土壤磨碎混

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匀后称取1g加入至装有玻璃珠的三角瓶中，并在其中注入10ml无菌水，然后置于摇床30℃，150r/min振荡30min，充分混合配置成土壤悬浮液；[0049](3)好氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气比例(N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1)用针筒打入相应量的N2、CO2和O2，用封口膜封口；将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中,以便排气；后将步骤(2)中的样品稀释液加入到装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床30℃，150r/min振荡30min，3d为一个富集周期，每个周期结束后重新充气，重复富集过程共3次得到目的菌液；、[0050](4)厌氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按有氧气氛的混合气比例空气∶CO2＝9∶1的条件下，用针筒打入，用封口膜封口，将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气，将步骤(3)的菌液转接到新的装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床30℃，150r/min振荡30min，3d为一个富集周期，培养一个周期后，再将无氧气氛混合气N2∶CO2＝9∶1用针筒打入血清瓶中，再以3d为一个富集周期，培养一个周期后，再在有氧气氛和无氧气氛条件下重复6个周期，最后得到目的菌液；

[0051](5)梯度平板分离：采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，运用涂布平板培养法，先将无碳氮培养基倒入无菌平板中，待凝固后编号10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每一号码设置三个重复，分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中，用涂布棒涂布于无碳氮培养基平板，将涂布好的平板平放于桌上静置5～10min，待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取形状不同的单菌落划线培养，其中单菌落为所筛选的微生物。[0052]其他与实施例1相同。[0053]实施例3

[00]一种兼性固碳氮微生物的筛选方法，包括以下步骤：

[0055](1)兼性固碳氮微生物无碳氮培养基的配制组份及用量：[0056]KH2PO4 0.25g、NaCl 25g、CaCl2 0.015g、FeSO4  1.25g、K2HPO4 2.25g、MgSO4·7H2O0.015g、电子传递物质2.5g、微量元素混合液2.5ml，加入蒸馏水至1000ml，123℃灭菌25min，pH值6.8；

[0057]其中微量元素混合液(mg/L)：  1.70mg、H3BO3 0.45mg、ZnSO4·7H2ONa2MoO4·2H2O

  1.25mg、NiSO4·7H2O 7.5mg、CoCl2·6H2O1.25mg、MnSO4·5H2O 1.25mg、CuSO4·5H2O

1.25mg；

[0058](2)微生物的选择：[0059]菌类采样方法：采样取湖泊中水面0.5m以下的水样1ml加入至装有玻璃珠的三角瓶中，并在其中注入9.5ml无菌水，然后置于摇床29℃，135r/min振荡25min，充分混合配置成土壤悬浮液；

[0060](3)好氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按混合气比例(N2∶CO2∶O2＝8.5∶0.5∶1)用针筒打入相应量的N2、CO2和O2，用封口膜封口；将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中,以便排气；后将步骤(2)中的样品稀释液加入到装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床30℃，135r/min振荡25min，2d为一个富集周期，每个周期结束后重新充气，重复富集过程共3次得到目的菌液；

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(4)厌氧驯化富集：采用排水换气法配气，将血清瓶装满水后，倒扣于水中，按有氧

气氛的混合气比例空气∶CO2＝9∶1的条件下，用针筒打入，用封口膜封口，将无碳氮培养基注入血清瓶中，同时另一针头通过胶塞插入血清瓶中，以便排气，将步骤(3)的菌液转接到新的装有无碳氮培养基的血清瓶中，然后置于摇床29℃，135r/min振荡25min，2.5d为一个富集周期，培养一个周期后，再将无氧气氛混合气N2∶CO2＝9∶1用针筒打入血清瓶中，再以2d为一个富集周期，培养一个周期后，再在有氧气氛和无氧气氛条件下重复5个周期，最后得到目的菌液；

[0062](5)梯度平板分离：采用10倍梯度稀释方法将目的菌液制成悬液浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，运用涂布平板培养法，先将无碳氮培养基倒入无菌平板中，待凝固后编号10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每一号码设置三个重复，分别吸取各梯度稀释液0.1ml于相应平板中，用涂布棒涂布于无碳氮培养基平板，将涂布好的平板平放于桌上静置5～10min，待菌液渗透于培养基内后30℃倒置培养；48h后挑取形状不同的单菌落划线培养，其中单菌落为所筛选的微生物。[0063]其他与实施例1相同。[00]验证分析[0065]发明组：将实施例1中筛选出来的微生物包括细菌、真菌和藻类微生物，分别在A、B两种培养基上在CO2、N2混合气气氛环境下进行培养，培养基A为实施例1中的无碳氮培养基；培养基B为论文《一种能同时固定CO2和N2的微生物--兼性固CO2、N2菌的分离鉴定及其验证实验》的兼性固碳氮培养基；[0066]对照组：将论文《一种能同时固定CO2和N2的微生物--兼性固CO2、N2菌的分离鉴定及其验证实验》筛选的细菌，分别在A、B两种培养基上在CO2、N2混合气气氛环境下进行培养，培养基A为实施例1中的无碳氮培养基；培养基B为论文《一种能同时固定CO2和N2的微生物--兼性固CO2、N2菌的分离鉴定及其验证实验》的兼性固碳氮培养基；[0067]具体效果验证的结果见表1、2所示。[0068]表1发明组和对照组微生物生存状况对比

[0069]

[0070][0071][0072]

表2不同培养基对细菌/真菌/藻类生长和筛选周期的影响

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从表1可以看出：对照组中的细菌、真菌和藻类可以在两种培养基中生存，而发明

组的细菌、真菌和藻类只有细菌可以在两种培养基中生存，而真菌和藻类不能在培养基B中生存，说明培养基B的适应筛选微生物的种类更少，不利于普遍利用；同时表2说明，本发明

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的培养基A可以有效提高培养速度，缩短筛选周期，大大提高了工作效率。

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