分子技术在湿地微生物群落解析中的应用

生态环境学报２０　１　０，１　９（４）：９７４．９７８　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｅｅｓｃｉ．ｔｏｍ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｅ—ｍａｉｌ：ｅｄｉｔｏｒ＠ｉｅｅｓｃｉ．ｃｏｍ　分子技术在湿地微生物群落解析中的应用　．　梁威　，吴苏青　，吴振斌　１．中国科学院水生生物所／／淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北武汉４３００７２；２．中国科学院研究生院，北京１０００４９　摘要：人工湿地的研究和应用近年来受到了广泛重视。微生物是人工湿地系统的重要组成部分，其群落结构对于湿地的净化　功能的发挥具有重要影响。与传统的微生物分析技术相比，分子生物学技术在解析人工湿地微生物群落结构时无需纯培养，　具有高效、快速、简便的特点，使其广泛应用于环境微生物的研究。文章综述了近年来在聚合酶链反应技术（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）基础上发展起来的几种新的分子生物技术，包括ＰＣＲ．ＤＧＧＥ、ＬＨ—ＰＣＲ、Ｔ—ＲＦＬＰ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＡＲＤＲＡ，　以及其在人工湿地微生物研究中的应用现状。通过这些分子技术，可以分析湿地处理特定废水过程中微生物的数量、丰度、　多样性及优势种；鉴定湿地中特定功能菌群（如氨氧化细菌、反硝化细菌、除硫菌等）的数量、活动分布、空间变更及与污　染物去除的关系；判断各种系统条件（如不同基质、植物、水力负荷等）的设置对微生物多样性和稳定性的影响。最后，对分　子技术在湿地领域的未来发展进行了展望。　关键词：分子技术；微生物群落；人工湿地；现状；展望　中图分类号：Ｘ１７２　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７４．５９０６（２０１０）０４．０９７４．０５　人工湿地在过去的几十年中得到迅速发展。许　链温度不同的原理，通过梯度变性胶将ＤＮＡ分开。　多研究表明，湿地微生物的作用是影响该系统去除　与其它电泳系统相比，它不是基于核酸分子量的不　污染物效率的重要因素之一，然而由于其复杂性及　同将ＤＮＡ片段分开，而是根据序列的不同将片段大　分析方法的局限性使得人们在研究和设计湿地系　小相同的ＤＮＡ序列分开。当双链ＤＮＡ分子在含梯度　统时只能将其作为一个黑箱而忽视。近代分子生物　变性剂（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电　学技术的发展克服了传统研究微生物时的培养需　泳时，其解链的速度和程度与其序列密切相关，相　求，为人工湿地微生物的多样性及其功能的深入分　同碱基对数目的双链ＤＮＡ分子由于碱基对组成的　析提供了一个崭新的途径【ｌ　Ｊ。　不同，解链所需要的变性剂浓度也不同，当某一双　目前用于湿地微生物群落结构分析的技术主　链ＤＮＡ序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其　要有平板计数法、荧光染色法、Ｂｉｏｌｏｇ微平板分析、　解链温度时，即开始部分解链，解链程度越大，迁移　微生物醌指纹法、磷脂脂肪酸（ＰＬＦＡ）谱图、荧光原　阻力大，ＤＮＡ分子的迁移速度随之减小，产生的迁　位杂交（ＦＩｓＨ）技术等＿４　】。近年来，变性梯度凝胶电　移阻力与电场力相平衡时，具有不同序列的ＤＮＡ片　泳、随机扩增多态性ＤＮＡ标记、单链构象多态性等　段则停留于凝胶的不同位置，形成相互分开的条带　方法在湿地研究中也开始应用，对湿地中微生物的　图谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，最低　研究起到显著的推动作用ｌ６　Ｊ。本文针对当前应用于　可检测到只有１个碱基差异的ＤＮＡ片段　…。　人工湿地研究中的主要分子技术进行综述，以期为　１．２　ＰＣＲ—ＤＧＧ　Ｅ在人工湿地研究中的应用　利用现代分子技术研究人工湿地的净化机理提供　１．２．１微生物数量、丰度及多样性　参考。　Ｄｏｎｇ等＿Ｊ　ｌＪ用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术鉴别分析用来处　１　ＰＣＲ—ＤＧＧＥ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃ－　理猪圈废水的湿地基质中微生物的情况，得出菌种　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　ＧｅＩ　Ｅｌｅｃｔｒｏ－　的分布与总磷、硝酸盐、磷酸盐的浓度显著相关，　ｐｈｏｒｅｓｉｓ）　从进水到出水中微生物的多样性及丰度显著降低，　１．１　ＤＧＧＥ原理　其优势种为Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．（假单胞菌），Ａｒｔｈｒｏｂａｃ—　ＤＧＧＥ（变性梯度凝胶电泳）技术是由Ｆｉｓｃｈｅｒ和　ｔｅｒ　ｓｐ．（节细菌属），Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．（杆状菌）。通过系统发　Ｌｅｒｍａｎ于１　９７９年最先提出的，主要是用于检测ＤＮＡ　育分析表明一部分１６Ｓ　ｒＲＮＡ的基因序列与不可培　突变的一种电泳技术。１９９３年Ｍｕｚｙｅｒｓ等首次将　植的反硝化细菌具有极大的相关性，而这些反硝化　ＤＧＧＥ技术应用于分子微生物学研究领域。ＤＧＧＥ　细菌的活动对湿地中氮的去除起着重要的作用。　利用序列不同的ＤＮＡ片段在聚丙烯酰胺凝胶中解　Ｙｉｎ等［１　］利用ＤＧＧＥ技术分析处理受污染景观湖水　基金项目：国家重大科技专项（２００８ＺＸ０７１０６．００３，２００８ＺＸ０７３１６—００４）；江苏省科技惠民项目（ＢＥ２００８６５ｔ）；中科院天津专项（ＴＪＺＸ２一Ｙｗ一０７）　作者简介：梁威（１９７１年生），男，副研究员，博士，主要研究方向为人工湿地、环境微生物学、水体生态修复等。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｌｉａｎｇ＠ｉｈｂ．ａｃ．ｃｎ　收稿日期：２０１０—０３—０２　梁威等：分子技术在湿地微生物群落解析中的应用　９７５　的三个水平潜流湿地中微生物的多样性、总的微生　物群落的改变以及氨氧化细菌的组成。通过ＰＣＲ对　３　Ｔ—ＲＦＬＰ　ｆＴｅｒｍｉｎａｌ—Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇ—　携带单加氧酶的基因序列进行扩增，得出季节的变　化对微生物群落的多样性和组成具有影响；序列分　ｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）　Ｔ—ＲＦＬＰ（末端限制性酶切片段长度多态性）分　析是在ＰＣＲ技术和ＲＦＬＰ技术基础上发展起来的微　生物群落分析技术，所不同的是在ＰＣＲ扩增１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的过程中，其中一个引物用荧光标记，　析说明湿地中氨氧化细菌是不可培养的，其菌群中　含有大量的亚硝化单胞菌类似序列。Ｇｕｏ等ｌｌ　利用　ＰＣＲ．ＤＧＧＥ技术分析人工湿地处理二级废水后混　合水中的微生物群落的结构，得出微生物菌群的多　样性。Ｇｏｒｒａ等　刮利用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ技术鉴别处理污　水的湿地基质对氨氧化细菌群落多样性和稳定性　的影响，结果表明不同基质上群落的组成没有很大　的区别，其中沸石最有利于氨氧化细菌的活动。　１．２．２特定微生物功能群　Ｄｒｅｗｅ等¨　通过嵌套的ＰＣＲｇ￣芦苇湿地进出　水、基质及植物根区等１５个位点上的Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ（鸟分支杆菌）进行监测，得出芦苇湿地对鸟分　支杆菌具有良好的去除作用，因而对鸟类肺结核具　有有效的控制作用。Ｐａｒｋ等＿ｌ。］（２００９）￣ＩＪＮ实时　ＰＣＲ技术鉴别和定量测定分别种植菖蒲、黄睡莲、　香蒲的表面流人工湿地中脱氮菌和除硫菌的活动　状况。Ｒｕｉｚ．Ｒｕｅｄａ等¨，Ｊ通过ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术鉴别了　湿地中阔叶香蒲和芦苇根际的硝化反硝化菌的活　动及其群落结构，并判断它与湿地中的植物种类的　相关性。Ｈｕａｎｇ￣＿Ｊ　ｊ应用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ技术调查处理　富营养观赏水的复合垂直流人工湿地中氨氧化细　菌的多样性及活动分布的空间变更，并测定氨氧化　细菌在湿地的不同层对富营养水的净化。Ｓｕｎｄｂｅｒｇ　等ｌ】　将氨氧化和反硝化菌群分别用目标１６Ｓ　ｒＤＮＡ　基因探针和功能基因ｎｏｓＺ进行ＰＣＲ扩增，结果由　ＤＧＧＥ及核苷酸序列分析，以检测用来处理高氮浓　度的垃圾掩埋浸析液的人工湿地中硝化和反硝化　作用及其相应的菌群。　２　ＬＨ—ＰＣＲ（Ｌｅｎｇｔｈ　Ｈｅｔｅｒｏｑｅｎｅｉｌｖ　ＰＣＲ）　ＬＨ．ＰＣＲ是于１９９８年在国外发展起来的一项　新技术Ｌ２…。在ＬＨ．ＰＣＲ中，荧光标记探针被用来决　定来源于不同微生物扩增序列的相对数量，带标记　的片段在电泳胶上被分离出来，而后被一个带有荧　光性激光的自动基因顺序分析仪所监测到。Ｎａｎｃｙ　等ｌ２　（２０００）３０用ＬＨ—ＰＣＲ技术评估土壤微生物群　的组成，并发现ＬＨ．ＰＣＲ的结果具有可重复性。　Ａｈｎ等Ｌ２　利用ＬＨ．ＰＣＲ在不同湿地植物和磷负　荷下采集人工湿地基质中微生物的指纹，通过对群　落菌群克隆和排序来确定其微生物的多样性；并应　用主坐标分析及相似性分析得出高磷负荷会使基　质微生物群落结构发生显著改变且能降低其多样　性，克隆排序表明不同的磷含量产生不同的微生物　群落。　在计算机程序自动分析时仅分析带荧光标记的末　端限制片段，这样使得限制片段长度多态性图谱更　为简化，且每个可见的条带都代表一个“核型”或一　个分类单元。相对于其它分子生物学分析技术如　ＲＦＬＰ、ＤＧＧＥ等，它具有分辨率高、易于实现自动　化［２３－２４　等特点。　Ｎｉｃｏｒａｒａｔ等　５Ｊ利用Ｔ．ＲＦＬＰ技术对处理酸化煤　矿水的人工湿地系统中微生物的多样性进行分析。　・将ＲＦＬＰ的结果与先前的有机体培养ＰＣＲ．ＤＧＧＥ和　ＦＩＳＨ研究结合起来，说明了相对低的微生物多样性　及嗜温硫杆菌在好氧湿地基质中具有优势。Ｉｓｈｉｄａ　等　６ｌ通过Ｔ—ＲＦＬＰ方法测定不同的水力负荷及水位　波动对湿地底泥中微生物结构的影响，并根据营养　物的去除情况确定湿地的性能。Ｓｅａｒｃｙ等［２７１利用　ＰＣＲ扩增每个生物菌膜样本上真核细菌的１６Ｓ　ｒＤＮＡ及亚硝酸还原酶基因，用Ｔ—ＲＦＬＰ技术分析扩　增产物判断整个菌群及反硝化细菌群落的多样性。　Ｓｌｅｙｔｒ等【２８］利用Ｔ．ＲＦＬＰ技术分析比较芦苇湿地和芒　竹湿地植物根区的微生物群落结构，发现不同的湿　地在相似的条件下运行具有相似的菌群结构。　４　ＰＣＲ—ＳＳＧＰ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｃｏｎｆｏｒｍａ－　ｔｉｏｎａｌ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）　４．１　ＰＣＲ—ＳＳＣＰ基本原理　单链构象多态性技术（简写为ｓｓｃＰ）是随着人　类基因组的研究而发展起来用于检测碱基突变的　技术。通过与ＰＣＲ方法相结合，ＰＣＲ扩增产物经变　性后，将得到具有二级构象的单链ＤＮＡ置于非变性　的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，空间构象不同的单　链ＤＮＡ会因其迁移率不同而得到分离，最后根据电　泳条带所显示的亮度、丰度、条带位置和清晰度等　基本信息进行ＳＳＣＰ图谱分析，确定不同菌株类型及　其相对数量关系等从而检测相应的遗传变异。　ＰＣＲ—ＳＳＣＰ技术被认为是环境微生物分子生态学研　究中，继变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）和末端限制性　片段长度多态性（Ｔ—ＲＦＬＰ）之后的又一技术ｌ２…。　４．２　ＰＣＲ—ＳＳＣＰ在人工湿地中的应用　谢冰等［３ｏＪ（２００７）采用ＰＣＲ．ＳＳＣＰ技术对上海　梦清园芦苇人工湿地的底泥微生物群落结构进行　了研究，发现湿地中微生物优势种主要是七种芽孢　杆菌。ＸＩＥ　Ｂ等【ｊ　ｕ（２Ｏ０９）再次利用ＰｃＲ—ＳＳＣＰ］￣谱分　析上海梦清园芦苇人工湿地进出口微生物的多样　９７６　性，得出异养菌、硝化细菌和反硝化细菌各个季节　的分布不一，微生物功能群的分布与湿地中不同营　养水平有关。Ｖａｃｃａ等ｐ引（２００５）￣ＩＪｍＰＣＲ．ｓｓｃＰ图谱　分析六个处理生活污水的实验型人工湿地进出口、　植物根区及基质不同深度的微生物群落的多样性，　以判断湿地中填料类型、植物种植与否对菌群的影　响，结果发现不同的微生物群落的存在与基质类型　有关。　５　ＡＲＤＲＡ　ｆＡｍｐｌｉｆｉｅｄ　ＲｉｂｏｓｏｍａＩ　ＤＮＡ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）　扩增ｒＤＮＡ限制性酶切片段分析法（简写为　ＡＲＤＲＡ）的技术原理是基于ＰＣＲ技术选择性扩增　ｒＤＮＡ片段（如１６Ｓ　ｒＤＮＡ、２３Ｓ　ｒＤＮＡ、１６Ｓ一２３Ｓ　ｒＤＮＡ片段），再对扩增的ｒＤＮＡ片段进行限制性酶　切片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）。该方法的步骤是：　１）提取　￣，ＤＮＡ；２）以总ＤＮＡ为模板，引物为ｒＲＮＡ　基因的保守序列，采用ＰｃＲ技术将特定的ｒＤＮＡ片　段扩增出来；３１选择多种有四对碱基识别位点的限　制性内切酶，对扩增产物进行限制性酶切；４）用低　熔点琼脂糖凝胶电泳分离酶切的ＤＮＡ片段；５）对　ＡＲＤＲＡ诊断谱带进行认定、特性的系统分析及计　算机聚类Ｉ３引。ＡＲＤＲＡ技术一般都需要同其它的分　子技术￣ｔｌＤＧＧＥ、Ｔ．ＲＦＬＰ等相结合使用。　Ｉｂｅｋｗｅ等ｌ３　］在变化植物密度和组成的湿地中　研究微生物群落的组成与水质之间的关系，六个月　中每星期对湿地的不同位点的水化学指标、硝酸　盐、正磷酸盐、悬浮固体进行检测。发现５０％的植　物覆盖率能将９６．３％的硝酸盐去除。采用ＤＧＧＥ获得　总的ＤＮＡ的群落图谱以测定湿地基质中、植物根区　及水中主要的微生物组成，并建立菌克隆文库，其　中３００多个克隆体用ＡＲＤＲＡ分析并整合到运算分　类单位中，得出湿地基质中、植物根区及水中分别　有３５、３１、３６个不同的分类单位，根据香农威尔指　数的计算说明５０％植物覆盖率的微生物多样性比　１００％的要高。　６展望　随着研究手段的多样化，人们对人工湿地微生　物群落结构的了解越来越深入；但尚未发现单一的　技术能够充分描述微生物的全部群落结构及其代　谢过程。为此，为进一步研究揭示湿地微生物群落　结构及其净化机理，建议加强以下方向的研究：　（１）利用分子技术研究人工湿地脱氮除磷的机　理，揭示湿地处理特定废水（低碳高氮废水、微污　染地表水、面源污染等）及其特定生物代谢过程（如　短程脱氮、反硝化除磷、同步硝化反硝化及厌氧氨　氧化）中微生物种群及其代谢状况；　（２）研究去除特殊污染物（如持久性有机污染　生态环境学报第１９卷第４期（２０１０年４月）　物ＰＯＰｓ）过程中，湿地微生物菌群的变化状况，探　寻净化机理；　（３）多种分子技术协同作用，利用各种技术　的优势，针对处理污水的性质不同，对比研究湿　地中微生物菌群结构、活性的变化，微生物种与　种之间的相互关系，深入研究与湿地系统条件的　相互关系；　（４）引进利用稳定同位素探测（ＳＩＰ）、基因　芯片等新技术应用研究湿地中微生物群落的变化　与生态学功能之间的关系，提高其对湿地中微生物　定量、定性的准确性和检测的特异性。　参考文献：　［１］ＪＥＮＮＩＦＥＲ　Ｌ，ＶＩＮＣＥＮＴ　Ｇ，ＣＡＲＩＮＡ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｅｔｌａｎｄｓ：Ａ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｅｃｏｌｏｇｉ—　ｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００９，３５：９８７—１００４．　［２］魏成，刘平．人工湿地污水净化效率与根际微生物群落多样性的相　关性研究【Ｊ】ｌ农业环境科学学报，２００８，２７（６）：２４０１—２４０６．　ＷＥＩ　Ｃｈｅｎｇ，ＬＩＵ　Ｐｉｎｇ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔ－　ｌａｎｄ［Ｊ］．Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，２７（６）：　２４０ｌ一２４０６．　［３］ＭＡＬＩＫ　Ｓ，ＢＥＥＲ　Ｍ，ＭＥＧＨＡＲＡＪ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｔｏ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｓｏｉｌ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００８，３４：２６５—２７６．　［４］　车玉伶，王慧，胡洪营，等．微生物群落结构和多样性解析技术研　究进展［Ｊ１．生态环境，２００５，１４（１）：１２７—１３３．　ＣＨＥ　Ｙｕｌｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｈｕｉ，ＨＵ　Ｈｏｎｇｙｉｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ　ｏｎ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ［ＪＪ．Ｅｃｏｌｏｇｙ　ｎａｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２００５，ｌ４（１）：１２７—１３３．　［５］许文涛，郭星，罗云波，等．微生物菌群多样性分析方法的研究进　展［Ｊ］．食品科学，２００９，３０（７）：２５８　２６５．　ＸＵ　Ｗｅｎｔａｏ，ＧＵＯ　Ｘｉｎｇ，ＬＵＯ　Ｙｕｎｂｏ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｌｆｏｒａ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，　３Ｏ（７）：２５８－２６５．　［６］ＴＲＵＵ　Ｍ，ＪＵＨＡＮＳＯＮ　Ｊ，ＴＲＵＵ　Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｂｉｏｍａｓｓ，ａｃｔｉｖｉｙｔ　ａｎｄ　ｃｏｍｍｕｎｉｙｔ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌｎａｄｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２００９，４０７：３９５８—３９７１．　［７］　ＫＡＲＩＮ　Ｓ　Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｗｅｔｌｎａｄ　ｓｃｉｅｎｃｅ［Ｊ］．　Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００９，３５：９５９—９６０．　［８］宫曼丽，任南琪，邢德峰．ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术及其在微生物分子生　态学中的应用［Ｊ］．微生物学报，２００６，４４（６）：４８５—４８８．　ＧＯＮＧ　Ｍａｎｌｉ，ＲＥＮ　Ｎａｎｑｑｉ，ＸＩＮＧ　Ｄｅｆｅｎｇ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃＵ＇ｏｐｈｏ—　ｒｅｓｉｓ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｃｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，　２００６，４４（６）：４８５－４８８．　［９］　ＭＵＹＺＥＲ　Ｇ，ＷＡＡＬ　Ｅ　Ｃ，ｕＩＴＴＥＲＬｎ　ＤＥＮ　Ａ　Ｇ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｍ－　ｐｌｅｘ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｆｏｒｌ６Ｓ　ｒＲＮＡ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，５９：　６９５．７００．　［１Ｏ］吴高锋，李文刚，高卫科，等．ＰＣＲ．ＤＧＧＥ的原理及在动物肠道菌　梁威等：分子技术在湿地微生物群落解析中的应用　群分析中的应用［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００８，３５（６）：３７—３９．　ＷＵ　Ｇａｏｆｅｎｇ，ＬＩ　Ｗｅｎｇａｎｇ，ＧＡＯ　Ｗｅｉｋｅ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ＰＣＲ－ＤＧＧＥ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｌｏｎｙ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，３５（６）：３７—３９．　［１】］ＤＯＮＧ　Ｘ　Ｌ，ＲＥＤＤＹ　Ｇ　Ｂ．Ｓｏｉｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌｎａｄｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｗｉｎｅ　ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ．．ＤＧＧＥ　ｔｅｃｈ．．　ｎｉｑｕｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１０１（４）：Ｉ　１７５一ｌ１８２．　［１２］ＹＩＮ　Ｊ，ＪＩＡＮＧ　Ｌ　Ｙ，ＷＥＮ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｌｕｔｅｄ　ｌａｎｄｓｃａｐｅ　ｌａｋｅ　ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｍｍｏｎｉａ—ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌｎａｄ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐａｒｔ　Ａ—Ｔｏｘｉｃ／Ｈａｚａｒｄｏｕｓ　Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．　２００９，４４（７）：７２２—７３　１．　［１３］ＧＵＯ　Ｊ　Ｆ，Ｌｕ　Ｙ　Ｊ．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｅｆｌｆｕｅｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｂｙ　ｐｉｌｏｔ—ｓｃａｌｅ　ｃｏｎ—　ｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ［Ｒ］．　３ｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｇｉ－　ｎｅｅｒｉｎｇ（ｉＣＢＢＥ　２００９），２００９．　［１４］ＧＯＲＲＡ　Ｒ，ＣＯＣＩ　Ｍ，ＡＭＢＲＯＳＯＬＩ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｍｏｎｉａ－ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ａ　ｃｏｎ－　ｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１０３（５）：１４４２—１４５２．　［１５］ＤＲＥＷＥ　Ｊ　Ａ，ＭＷＡＮＧＩ　Ｄ，ＤＯＮＯＧＨＵＥ　Ｈ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ　ｉｎ　ａ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｒｅｅｄ　ｂｅｄ，ｗｉｔｈ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ａｖｉａｎ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．Ｆｅｍｓ　Ｍｉ—　ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００９，６７（２）：３２０・３２８．　［１６］ＰＡＲＫ　Ｎ，ＬＥＥ　Ｊ，ＣＨＯＮ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌｎａｄｓ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｐｅｃｔ　ｔｏ　ｎｉｔｒａｔｅ　ａｎｄ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２００９，１（１—３）：１７２—１７９．　［１７］ＲＵＩＺ—ＲＵＥＤＡ　Ｏ，ＨＡＬＬ１Ｎ　Ｓ，ＢＡＮＥＲＡＳ　Ｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ａ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ［Ｊ］．Ｆｅｍｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，　２００９，６７（２）：３０８－３１９．　［１８】ＨＵＡＮＧ　Ｄ　Ｆ，ＬＩ　Ｔ．Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｍｏ－　ｎｉａ・・ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｖｅｒｔｉｃａｌ—ｆｌｏｗ　ｃｏｎ．．　ｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄｓ［Ｊ］．Ｈｕａｎｊｉｎｇ　Ｋｅｘｕｅ，２００８，２９（８）：２１６０－２１６５．　［１９］ＳＵＮＤＢＥＲＧ　Ｃ，ＴＯＮＤＥＲＳＫＩ　Ｋ，ＬＩＮＤＧＲＥＮ　Ｐ　Ｅ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｎｉｔｒｉｆｉｃａ—　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂａｃ—　ｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ａ　ｃｏｍｐａｃｔ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ｌａｎｄｆｉｌｌ　ｌｅａｃｈａｔｅｓ［Ｊ］Ｗａｔｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，５６（３）：１５９—１６６．　［２０］ＳｕｚＵＫＩ　Ｍ，ＲＡＰＰＥ　Ｍ　Ｓ，ＧＩＯＶＡＮＮＯＮＩ　Ｓ　Ｊ．Ｋｉｎｅｔｉｃ　ｂｉａｓ　ｉｎ　ｅｓｔｉ．　ｍａｔｅｓ　ｏｆ　ｃｏａｓｔａｌ　ｐｉｃｏｐｌａｎｋｔｏｎ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｓ－　ｕｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ－ｓｕｂｕｎｉｔ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｃｏｎ　ｌｅｎｇｔｈ　ｈｅｔｅｒｏ—　ｇｅｎｅｉｔｙ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６４（１　１）：　４５２２—４５２９．　［２１］ＮＡＮＣＹ　Ｊ，ＭＡＲＹ　Ｅ，ＲＩＣＨＡＲＤ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｕｓｅ　ｏｆＬｅｎｇｔｈ　Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｍｅｔｈｙｌ　Ｅｓｔｅｒ　Ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｔｏ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｓｏｉｌ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２０００，６６（４）：１６６８—１６７５．　［２２］ＡＨＮ　Ｃ，ＧＩＬＬＥＶＥＴ　Ｐ　Ｍ，ＳＩＫＡＲＯＯＤＩ　Ｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ　ｗｅｔｌａｎｄｓ　ａｓ　ｉｎｆｌｕ．　ｅｎｃｅｄ　ｂｙ　ｍａｃｒｏｐｈｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｌｏａｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｉｃａ－　９７７　／ｏｒｓ，２００７，７（４）：８５２—８６３．　［２３］余素林，吴晓磊，钱易．环境微生物群落分析的Ｔ—ＲＦＬＰ技术及其　优化措施［Ｊ］．应用与环境生物学报，２００６，１２（６）：８６１－８６８．　ＹＵ　Ｓｕｌｉｎ，ｗＵ　Ｘｉａｏｌｅｉ，ＱＩＡＮ　Ｙｉ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ－ＲＦＬＰ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｒ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｐｐｌｉｅｄ　ｎａｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１２（６）：８６１－８６８．　［２４］李献梅，王小芬，崔宗均．末端限制性片段长度多态性技术　（Ｔ　ＲＦＬＰ）在微生物群体分析　的应用与技术优化［Ｊ］．中国农业大　学学报，２００９，１４（４）：１－９．　ＬＩ　Ｘｉａｎｍｅｉ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏｆｅｎ，ＣＵＩ　Ｚｏｎｇｊｕｎ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉ・　ｚａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｔ－－ＲＦＬＰ　ｉｎ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｏｐｕｌａ・－　ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００９，ｌ４（４）：１－９．　［２５】ＮＩＣＯＲＡＲＡＴ　Ｄ，ＤＩＣＫ　Ｗ　Ａ，ＤＯＰＳＯＮ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｈｙｌｏｇｅ—　ｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ａ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ａｃｉｄ　ｃｏａｌ　ｍｉｎｅ　ｄｒａｉｎａｇｅ［Ｊ］．Ｓｏｉｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｎａｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４Ｏ（２）：３１２－３２１．　［２６］ＩＳＨＩＤＡ　Ｃ　Ｋ，ＫＥＬＬＹ　Ｊ　Ｊ，ＧＲＡＹ　Ｋ　Ａ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｈｙｄｒｏｐｅ－　ｒｉｏｄｓ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ　ｌｅｖｅｌ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｄｅｎｉｔｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ，ｎｉｔｒａｔｅ　ｒｅｍｏｖａｌ，ａｎｄ　ｂｅｎｔｈｉｃ—ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｉｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄｓ［Ｊ］．Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００６，２８（４）：３６３—３７３．　［２７］ＳＥＡＲＣＹ　Ｋ　Ｅ，ＰＡＲＳＥＫ　Ｍ　Ｒ．Ｄｅｎｉｔｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｂｉｏｆｉｌｍ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ［Ｒ］．Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１　０２：４２４．　［２８］ＳＬＥＹＴＲ　Ｋ，ＴＩＥＴＺ　Ａ，ＬＡＮＧＥＲＧＲＡＢＥＲ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｓｕｂｓｕｒｆａｃｅ　ｖｅｒｔｉｃａｌ　ｆｌｏｗ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔｌｎａｄｓ［Ｊ］．　Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００９，３５（６）：１０２１－１０２５．　［２９］王岩，沈锡权，吴祖芳，等．ＰＣＲ—ＳＳＣＰ技术在微生物群落多态性　分析中的应用进展［Ｊ］＿生物技术，２００９，１３（９）：８４—８７．　ＷＡＮＧ　Ｙａｎ，ＳＨＥＮ　Ｘｉｑｕａｎ，ＷＵ　Ｚｕｆｎａｇ，ｅｔ　ａ１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＲ－ＳＳＣＰ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉ－　ｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，１３（９）：８４—８７．　［３０］谢冰，董亮．芦苇人工湿地底泥微生物群落结构的ＰＣＲ—ＳＳＣＰ技术　研究［Ｊ１．农业系统科学与综合研究，２００７，２３（２）：２０５－２１　１．　ＸＩＥ　Ｂｉｎｇ，ＤＯＮＧ　Ｌｉａｎｇ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒｅｅｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ—ＳＳＣＰ［Ｊ］．Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２００７，２３（２）：２０５－２　１　１．　［３１］ＸＩＥ　Ｂ，ＣＵＩ　Ｙ　Ｘ，ＹＵＡＮ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ　ｒｅｍｏｖａｌ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ａ　ｒｅｅｄ　ｗｅｔｌｎａｄ　ｏｆ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｍｅｎｇｑｉｎｇ　Ｐａｒｋ［Ｊ］．　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ＆Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　Ｅｎｅｒｇｙ，２００９，２８（２）：２４０－２４８．　［３２］ＶＡＣＣＡ　Ｇ，ＷＡＮＤ　Ｈ，ＮＩＫＯＬＡＵＳＺ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｉｆｌｔｅｒ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｉｎ　ｐｉｌｏｔ．－ｓｃａｌｅ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔ．．　１ａｎｄｓ［Ｊ］．Ｗａｔｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，３９（７）：１３６１—１３７３．　［３３］陈晓蕾，张忠译．微生物的ＡＲＤＲＡ检测［Ｊ］．微生物学杂志，１９９９，　１９ｆ４１：４０—４３．　ＣＨＥＮ　Ｘｉａｏｌｅｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｏｎｇｙｉ．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｂｙ　ＡＲＤＲＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１９（４）：４０－４３．　［３４］ＩＢＥＫＷＥ　Ａ　Ｍ，ＬＹＯＮ　Ｓ　Ｒ，ＬＥＤＤＹ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｎｓｉｙｔ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｎ　ｗａｔｅｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｆｒｏｍ　ａ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔｌｎａｄ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１Ｏ２（４）：　９２１—９３６．　９７８　生态环境学报第１９卷第４期（２０１０年４月）　Ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｔｏ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｃ０ｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ＬＩＡＮＧ　Ｗｅｉ　，ＷＵ　Ｓｕｑｉｎｇ　，ＷＵ　Ｚｈｅｎｂｉｎ　１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＦｒｅｓｈｗａｔｅｒ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／／Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ＯｆＨｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ　４３００７２，Ｃｈｉｎａ．　２．Ｇｒａｄｕａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００４９，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｈａｖｅ　ｂｅｃｏｍｅ　ａ　ｈｏｔ　ｔｏｐｉｃ　ｉｎ　ｒｅｃｅｎｔ　ｙｅａｒｓ．Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｓｔｕｒｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｈａｖｅ　ｇｒｅａｔ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｅｃｈ—　ｎｉｑｕｅｓ　ｈａｖｅ　ｍａｎｙ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ，ｆａｓｔ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｗｉｄｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ），ｓｕｃｈ　ａｓ　ＰＣＲ・ＤＧＧＥ，ＬＨ－ＰＣＲ，Ｔ－ＲＦＬＰ，ＰＣＲ—ＳＳＣＰ　ａｎｄ　ＡＲＤＲＡ，ｗｅｒｅ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅｓｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｎｕｍｂｅｒ，ｄｅｎｓｉｔｙ，ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ｈｔｅ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ（ｓｕｃｈ　ａｓ　ｓｗｉｎｅ　ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ，ｌａｎｄｆｉｌｌ　ｌｅａｃｈａｔｅｓ，ｅｔｃ．）　ｃａｎ　ｂｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ；ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ，ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｓｐａｃｅ　ｓｈｉｆｔｉｎｇ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｒｏｕｐ　（ｓｕｃｈ　ａｓ　ａｍｍｏｎｉａ—ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ｄｅｎｉｔｒｉｉｆｅｒｓ，ｓｕｌｆａｔｅ　ｒｅｄｕｃｅｒｓ，ｅｔｃ．）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｍａｉｎ　ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ；　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（ｓｕｃｈ　ａｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｗｅｔｌａｎｄ　ｐｌａｎｔｓ，ｈｙｄｒａｕｌｉｃ　ｌｏａｄｉｎｇ，ｅｔｃ．）ｃａｎ　ｂｅ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ；Ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｗｅｔｌａｎｄ，ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｄｖａｎｃｅｓ；ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ