用于病毒高通量测序样品前处理及核酸扩增方案概述

Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　中国兽医杂志２０１６年（第５２卷）第１２期１１５　用于病毒高通量测序样品前处理及　核酸扩增方案概述　杨德全，鞠厚斌，刘　健，葛菲菲，李　鑫，王　建，杨显超，邓　波，葛　杰，周锦萍　（上海市动物疫病预防控制中心，上海闵行２０１１０３）　中图分类号：￥８５５．３　文献标志码：Ｂ　文章编号：文章编号：０５２９—６００５（２０１６）１２—０ｌ１５—０２　随着测序技术水平的改进，测序通量的不断提　高，高通量测序技术得到迅猛的发展与普及，其在　病毒学领域的应用也越来越广泛。通常，有效的降　低宿主细胞和其他微生物基因的干扰并提高病毒　核酸的丰度是鉴别病毒的重要前提，分离、扩增、获　取目的基因的序列则是鉴别病毒的关键。然而，临　床上获得的样品中病毒含量一般较低，从少量高度　复杂的临床样品中发现目的序列如同“大海捞针”，　收稿日期：２０１６－０５－０３　基金项目：上海市市级农口系统青年人才成长计划项目［沪农　因此，如何特异性的放大样品中的病毒含量显得至　关重要。本文就高通量测序技术中一些常用的从　未经培养的原始样品中获取病毒核酸序列的技术　方法作一综述，以期使科研工作者更好的掌握高通　量测序技术在病毒学中的应用。　不　不　！　不　；．　．　’矫　青字（２０１５）第２—６号］　作者简介：杨德全（１９８３一），男，兽医师，硕士，主要从事动物病　毒病防控工作，Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｅｑｕａｎ—ｙａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ　通讯作者：周锦萍，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈｚｊｐｖｅｔ＠１６３．ｃｏｍ　！：　矫　８讨论　检测提出的推断相吻合，＿９　至于动物源性蛋白质　过敏原的确切成分，还有待开展进一步的深入研究　确定。　有关大熊猫慢性营养不良综合征的发病原因，　国内外已开展过部分探索，但至今也未明确真正的　原因。伦敦动物园曾通过免疫学方法分析后认为，　该病的发生与食物中的卵清蛋白高度相关　ｍ　Ｊ。张　金国等（１９９８）报道，该病病因与低Ｌ综合征相　关　Ｊ。余建秋等（１９９８）报道，患该病大熊猫除表现　参考文献：　［１］　张金国．大熊猫常见疾病的防治概况［ｃ］．成都国际大熊猫保　护学术研讨会论文集，成都：四川科技出版社，１９９４：　３５９－３６６．　［２］　张金国，张成林．大熊猫营养不良研究［ｃ］．成都国际大熊猫　为低蛋白血症外，最明显的表现为毛发中ｃｕ、ｚｎ、　Ｍｎ等微量元素含量极显著低于健康个体　］。张成　林等（２０１４）认为，消化吸收障碍是引发大熊猫发生　该病病因　Ｊ。而笔者通过采集患病大熊猫血液、粪　便和结肠黏膜开展包括血液学、细菌学、病毒学、寄　生虫学和病理组织学系列研究后发现，大熊猫患该　保护学术研讨会论文集，成都：四川科技出版社，１９９８：　２２ｌ—２２４．　［３］余建秋，叶智勇，李光汉．大熊猫慢性胃肠炎研究［ｃ］．成都国　际大熊猫保护学术研讨会论文集，成都：四川科技出版社，　１９９８：２２８－２３３．　［４］Ｄａｖｉｄ　Ｅ．Ｗｉｌｄｔ，Ａｎｊｕ　Ｚｈａｎｇ，Ｈｅｍｉｎ　Ｚｈａｎｇ，Ｄｏｎａｌｄ　Ｌ．Ｊａｎｓｓｅｎ，　Ｓｕｓｉｅ　Ｅｌｌｉｓ．Ｇｉａｎｔ　Ｐａｎｄａｓ［Ｍ］．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００６：３７－９９．　病的原因与传统人工精料中的动物源性蛋白质高　度相关　。本文根据动物源性蛋白质过敏理论，采　［５］　张成林，夏茂华，杨明海，等．圈养大熊猫营养不良综合症研究　［Ｊ］．野生动物学报，２０１４，３５（３）：２７１—２７６．　用以肠道营养液替代富含动物源性蛋白质的人工　精料并辅助甲硝唑进行脱敏治疗方案，先后对成都　大熊猫种群中８只患病个体进行了诊断Ｉ生治疗。诊　断性治疗结果显示，所有接受该方案治疗的８只患　［６ｊ　王成东，王强，牛李丽．亚成体大熊猫顽固性胃肠功能紊乱伴　严重厌食治疗［ｃ］．成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集，　成都：四川科技出版社，１９９８：２２５—２２７．　［７］　王成东，Ｃａｒｌｏｓ　Ｓａｎｅｈｅｚ，罗娌，等．大熊猫慢性营养不良综合症　病因学研究［Ｊ］．野生动物学报，２０１６，３７（４）：３０１＿３０６．　［８］　陈灏珠．实用内科学（下册）［Ｍ］，ｌ０版．北京：人民卫生出版　社．１９９７：１９３４－１９３６．　病大熊猫，在经历１个疗程治疗后全部康复，治愈率　达１００％，且无ｌ例个体在回归正常饲养管理模式　下出现病情反复。治疗性诊断结果表明，大熊猫慢　［９］　Ｋｎｉｇｈｔ　Ｊ，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ　Ｊ，Ｐａｃｋ　Ｓ，Ｓａｍｅｒ　Ｍ．Ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｉｌｌｎｅｓｓ　性营养不良综合征的发病原因确实为人工精料中　动物源性蛋白质所导致，与伦敦动物园通过免疫学　ｉｎ　ａ　ｇｉａｎｔ　ｐａｎｄａ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ，１９８２，１２（２５）：１４５０—１４５１．　［１０］Ｆｒａｐｅ　Ｄ　Ｌ，Ｃａｓｈ　Ｒ　Ｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓ　Ｓ　Ｗ．Ｐａｎｄａｆｏｏｄ　ａｌｌｅｒｇｙ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ，１９８３，４（１６）：８７０－８７１．　１１６中国兽医杂志２０１６年（第５２卷）第１２期　１　样品前处理　临床样品复杂多样，不仅含有大量的宿主基　因，还混杂有细菌等其他微生物。它们产生的序列　往往“淹没”了低丰度的病毒序列，因此，样品前处　理非常关键，有必要采取措施减少无关序列的干　扰，同时进一步富集病毒。　１．１样品类型液体类样品，包括血液、血清、脑脊　液、精液等，正常情况下病原菌极少，但会有少量宿　主核酸的干扰，尤其是新鲜的样品，宿主ｇＤＮＡ和　ｒＲＮＡ等背景核酸含量较低，可以直接用于建库　测序　。　组织类样品，包括心脏、肝脏、肺脏等组织，由　于有大量宿主的核酸干扰，测序前需要去掉宿主　ｇＤＮＡ和ｒＲＮＡ等背景核酸。　拭子类样品，包括咽拭子、鼻拭子、肛拭子等，　不但有病原菌，还存在大量正常寄生菌群，核酸背　景复杂。　环境类样品，包括粪便、水、土壤等，含有的微　生物种类和数量很多，近些年来，通过病毒宏基因　组发现了大量已知和未知的病毒。　１．２背景物质的去除　由于病毒颗粒远远小于细　菌和其他细胞，可以通过离心、滤器过滤等物理方　法去除样品中的细胞、细胞碎片及细菌等大颗粒　物质　。　如何有效地去除宿主核酸，提高病毒核酸的丰　度是国际上公认的技术难点和关键点　Ｊ。通常，向　样品中加入核酸酶不但能降解宿主的背景核酸，同　时也能降解游离的病原体核酸。由于大部分病毒　核酸一般有衣壳包裹，存在于病毒颗粒内，可以抵　抗核酸酶的作用…。因此，可用ＤＮａｓｅ　Ｉ降解游离　的宿主ｇＤＮＡ，加入ＲＮａｓｅ　Ａ降解游离的宿主　ｒＲＮＡ。　１．３样品富集与浓缩　由于病毒颗粒具有一定的　密度，可以用超速离心处理样品　，提高病毒的浓　度和纯度，然后提取病毒核酸。目前，一般多采用　截留分子量为１００　ｋＤ的浓缩膜或超滤管对样品进　行浓缩。国内外学者　在高通量测序时采用该方　法均获得了良好的效果。　具体试验时，可有选择的将上述方法结合使　用。Ａｌｌａｎｄｅｒ　Ｔ等　对呼吸道样品处理时，将超速　离心、过滤和ＤＮａｓｅ　Ｉ消化相结合，发现了人细小病　毒。研究发现，离心、过滤、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ酶解三步　法对样品中病毒核酸丰度有显著提升作用　。此　外，可运用ＳＹＢＲ金染色法实时监测处理样品中病　毒颗粒的数量　。　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２核酸扩增方案　目前，市场上竞相推出了针对低浓度样品的文　库制备试剂盒，但对于更低浓度的样品，现有的低　浓度建库试剂盒显得无能为力。因此，如何能够特　异性地放大样品中的病毒含量，满足高通量测序需　求，变得至关重要。下面介绍几种常用于二代测序　低浓度样品的非特异性扩增方法。　２．１不依赖序列的单引物扩增（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎｄｅ．　ｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｉｎｇｌｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＳＩＳＰＡ）　ＳＩＳＰＡ　技术于１９９１年建立，其方法需要在ＤＮＡ模板钝末　端连接一非对称引物，经若干循环的变性、退火和　延伸后，模板的数量得到扩增，后经克隆、测序、分　析得到基因序列　Ｊ。国内外研究者　采用　ＳＩＳＰＡ技术测定了未知ＤＮＡ及ＲＮＡ病毒的序列。　国外学者们应用ＤＮａｓｅ．ＳＩＳＰＡ从临床样品中鉴定　出牛和人的新病毒　川。Ｄｊｉｋｅｎｇ　Ａ等　在此基　础上进行了改进，将ＲＮａｓｅ酶处理加入到ＳＩＳＰＡ　技术的程序中，以清除背景ＲＮＡ的污染。针对部　分有ｐｏｌｙ（Ａ）尾的病毒，在反转录过程中采用带　标签序列的随机引物（ＦＲ２６ＲＶ—Ｎ：５一　ＧＣＣＧ—　ＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＮＮＮＮＮＮ一３，）及连接ｐｏｌｙＴ　的引物（ＦＲ４０ＲＶ．Ｔ：５．　ＧＣ　ＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣ　ＡＧ－　ＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ一３　）以增加一３’端　的覆盖率。　随着二代测序的普及，经过ＳＩＳＰＡ获得的扩增　子可以直接深度测序。利用ＤＮａｓｅ　ＳＩＳＰＡ—ＮＧＳ技术　从比利时牛脑组织和组织培养物中鉴定出不同于　２０１１年首次在德国流行的施马伦贝格病毒¨　。有　学者用ＳＩＳＰＡ结合二代测序技术，对一个病毒的单　斑或低至１０　ｐｇ的ＤＮＡ模板进行测序，获得了高质　量的数据，直接用于病毒基因组全长的从头　拼接　。　２．２　ＶＩＤＩＳＣＡ技术（Ｖｉｒｕｓ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｃＤＮＡ—ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＶＩＤＩＳＣＡ）　ＶＩＤＩＳＣＡ　技术，是一种基于ｃＤＮＡ扩增片段长度多态性的方　法，是ＳＩＳＰＡ的一种衍生方法，利用该方法于２００４　年成功获得了一种新的人冠状病毒ＨＣｏＶ・ＮＬ６３　核酸。与ＳＩＳＰＡ不同的是，先用两种不同的限制性　内切酶切割ＤＮＡ，与之对应的两种ａｄａｐｔｏｒ相连接，　后与ａｄａｐｔｏｒ序列互补的两个引物进行第一轮ＰＣＲ　扩增；第二轮扩增时，将第一轮两个引物的一３’端分　别向前延伸一个碱基（Ａ或Ｔ或Ｇ或Ｃ），这样就会　产生１６种引物组合，大大提高ＶＩＤＩＳＣＡ的敏感性。　此后，应用该技术成功的鉴定出人双埃可病毒１　型　和５型、６型＿ｌ　。经过ＶＩＤＩＳＣＡ技术获得的　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　扩增子也可以直接深度测序。近几年，利用ＶＩＤＩＳ—　ＣＡ－４５４技术，在人　和动物¨　身上发现了许多新　病毒。　２．３　随机ＰＣＲ（ｒａｎｄｏｍ—ＰＣＲ，ｒＰＣＲ）　ｒＰＣＲ关键　在于其特殊的引物设计，在随机引物的５一’端加上　～段通用序列，内含一个限制性酶切位点便于后续　的克隆，用此引物进行第一轮扩增，第二轮引物则　使用与通用序列互补的引物。与ＳＩＳＰＡ不同的是，　不用连接接头，这种方法可提高反应的效率，因此　比ＳＩＳＰＡ更高效。ｒＰＣＲ可用于检测ＤＮＡ或ＲＮＡ　病毒。２００４年发现了新型冠状病毒ＨＣｏＶ－ＮＬ　；　Ｋａｐｏｏｒ　Ａｌ】　利用这种方法发现了博卡病毒２型。　将ｒＰＣＲ与二代测序技术相结合，Ｂｏｄｅｗｅｓ　Ｒ　等鉴　定出犬博卡病毒２型。　２．４多重置换扩增（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｉｆｃａ—　ｔｉｏｎ，ＭＤＡ）　ＭＤＡ是一种等温扩增技术，利用随机　的６碱基引物在多位点和模板链结合，接着利用　ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶很强的模板结合和置换能力实现　对全基因组的扩增。该技术可扩增一些极低含量　的样品，也可用于扩增不同环境样品中的病原体，　如人类粪便中的病毒　。ＭＤＡ法是目前公认应用　最广泛的全基因组扩增方法，操作简单，对实验仪　器要求低，且使用非预变性的模板时也可取得良好　的效果。目前针对该方法开发的产品较为成熟，具　有代表性的为Ｑｉａｇｅｎ公司的ＲＥＰＬＩ—ｇ系列全扩增　试剂盒和ＧＥ公司的ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ系列全扩增试　剂盒。　上述扩增方法均不依赖于病毒的核酸序列信　息，且可对低浓度样品高效放大，因此，在病毒核酸　信息未知的情况下，可对临床样品进行高通量测　序。由于上述很多方法的扩增产物并不是原始样　品中所有组成部分的等比例放大，或多或少会产生　一些偏倚，应避免过度扩增，尽量保持样品中核酸　的多样性。上述方法各有自己的优缺点，应根据样　品的具体情况及实验中遇到的问题进行调整、优化　或联合应用。　参考文献：　安小平，童贻刚．用于高通量测序未知病原体分析的样本预处　理方法及扩增方案概述［Ｊ］．生物技术通讯，２０１５，２６（２）：　２８６－２９０．　［２］　Ｄｊｉｋｅｎｇ　Ａ，Ｈａｌｐｉｎ　Ｒ，Ｋｕｚｍｉｃｋａｓ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｖｉｒｌａ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，９（１）：５．　［３］　Ｗｙｌｉｅ　Ｋ　Ｍ，Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ　Ｇ　Ｍ，Ｓｔｏｒｃｈ　Ｇ　Ａ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｖｉｅｗ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕ．　ｍａｎ　ｖｉｒｏｍｅ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｌ　Ｒｅｓ，２０１２，１６０（４）：２８３—２９０．　［４］　Ａｌｌａｎｄｅｒ　Ｔ，Ｔａｍｍｉ　Ｍ　Ｔ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｐａｒ－　ｖｏｖｉｒｕｓ　ｂｙ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｔｒａｃｔ　ｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．　Ｐｒｏｃ　Ｎｏｄ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００５，１０２：１２８９１－１２８９６．　中国兽医杂志２０１６年（第５２卷）第１２期　１１７　［５］　Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ　Ｍ，Ｈｅｗｓｏｎ　Ｉ，Ｆｅｌｔｓ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　ａｎ　ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｖｉｒａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｆｅｃｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　２００３，１８５（２０）：６２２０－６２２３．　［６］　裴广倩．纯培养微生物全基因组深度测序方法研究［Ｄ］．合　肥：安徽医科大学，２０１４．　［７］　Ｈａｌｌ　Ｒ　Ｊ．Ｗａｎｇ　Ｊ，Ｔｏｄｄ　Ａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｐｒｉｏｒ　ｔｏ　ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ　ｖｉｕｒｓ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１９５（１）：１９４—２０４．　［８］　Ｒｅｙｅｓ　Ｇ　Ｒ，Ｋｉｍ　Ｊ　Ｐ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｓｉｎｇｌｅ—ｐｒｉｍｅｒ　ａｍｐｌｉｉｆ—　ｃａｔｉｏｎ（ＳＩＳＰＡ）ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ＤＮＡ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｂｅ，　１９９１，５（６）：４７３－４８１．　［９］　ＡｌｌａｎｄｅｒＴ，Ｅｍｅｒｓｏｎ　Ｓ　Ｕ，Ｅｎｇｌｅ　Ｒ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｖｉｕｒｓ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｍｅｔｈ—　ｏｄ　ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ　ＤＮａｓｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｆ－　ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００１，９８（２０）：１１６０９—１１６１４．　［１０］　Ｚｈａｎｇ　Ｔ，Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ　Ｍ，Ｌｅｅ　Ｗ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．ＲＮＡ　ｖｉｒａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｆｅｃｅｓ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｖｉｕｒｓｅｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，４（１）：３．　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｈｏｅｋ　Ｌ，Ｐｙｒｅ　Ｋ，Ｊｅｂｂｉｎｋ　Ｍ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｏｎａｖｉｕｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４，１０（４）：　３６８－３７３．　［１２］　Ｒｏｓｓｅｅｌ　Ｔ，Ｓｃｈｅｕｃｈ　Ｍ，Ｈ￣ｐｅｒ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．ＤＮａｓｅ　ＳＩＳＰＡ—Ｎｅｘｔ　Ｇｅｎｅｒ－　ａｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｎｆｉｒｍｓ　Ｓｃｈｍａｌｌｅｎｂｅｒｇ　Ｖｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｂｅｌｇｉａｎ　Ｆｉｅｌｄ　Ｓａｍｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｅｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｕｒｏｐｅ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１２，７（７）：ｅ４１９６７．　［１３］　ＤｅＰｅｗ　Ｊ，Ｚｈｏｕ　Ｂ，ＭｃＣｏｒｒｉｓｏｎ　Ｊ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｖｉｒａｌ　ｇｅ—　ｎｏｍｅｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｐｌａｑｕｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２０１３，１０　（１）：１８１．　［１４］　ｄｅ　Ｓｏｕｚａ　Ｌｕｎａ　Ｌ　Ｋ，Ｂａｕｍｇａｒｔｅ　Ｓ，Ｇｒｙｗｎａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　ｈｕｍａｎ　ｐａｒｅｃｈｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　ｂｙ　ＶＩＤＩＳＣＡ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｆｕｌｌ　ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２００８，５：２６．　［１５］　ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ　Ｍ，Ｐｙｒｃ　Ｋ，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　ｐａｒｅｃｈｏｖｉｕｒｓ　ｔｙｐｅ　１，３，４，５，ａｎｄ　６　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉ—　ｃｒｏｂｉｏｌ，２００８，４６（２）：７５９－７６２．　［１６］　ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ　Ｍ，Ｏｕｄｅ　Ｍｕｎｎｉｎｋ　Ｂ　Ｂ，Ｄｅｉｊｓ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ＶＩＤＩＳＣＡ－４５４　ｉｎ　Ｆｅｃｅｓ—Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｓｅｒｕｍ［Ｊ］．Ｖｉｕｒｓｅｓ，　２０１２，４：１３２８—１３３４．　［１７］　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｈｅｉｊｄｅｎ　Ｍ，ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ　Ｍ，ｖａｎ　Ｓｔｅｅｎｂｅｅｋ　Ｆ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅ—　ｑｕｅｎｅｅ・－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＶＩＤＩＳＣＡ－４５４　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｔｏ　ｄｉｓｃｏｖｅｒ　ｎｅｗ　ｖｉ．　ｕｒｓｅｓｉｎ　ｃａｎｉｎｅｌｉｖｅｒｓ［Ｊ］．Ｊ　ＶｉｒｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，２０１２，１８５（１）：１５２—　１５５．　［１８］　Ｆｏｕｃｈｉｅｒ　Ｒ　Ａ，Ｈａｒｔｗｉｇ　Ｎ　Ｇ，Ｂｅｓｔｅｂｒｏｅｒ　Ｔ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ｕｎｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｈｕ—　ｍａｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｅａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００４，１０１：６２１２—６２１６．　［１９］　Ｋａｐｏｏｒ　Ａ，Ｓｌｉｋａｓ　Ｅ，Ｓｉｍｍｏｎｄｓ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｎｅｗｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｂｅ—　ｃａｖｉｒｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｔｏｏｌ［Ｊ］．Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，２００９，１９９（２）：　１９６—２００．　［２Ｏ］　Ｂｏｄｅｗｅｓ　Ｒ，Ｌａｐｐ　Ｓ，Ｈａｈｎ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｎｏｖｅｌ　ｃａｎｉｎｅ　ｂｏｃａｖｉｒｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｅｖｅｒｅ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　ｉｎ　ａ　ｄｏｇ　ｌｉｔｔｅｒ［Ｊ］．Ｖｅｔ　Ｍｉｃｍｂｉｏｌ，　２０１４，１７４（１－２）：１－８．　［２１］　Ｒｅｙｅｓ　Ａ，Ｈａｙｎｅｓ　Ｍ，Ｈａｎｓｏｎ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｖｉｕｒｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆａｅｃａｌ　ｍｉｃｒｏ—　ｂｉｏｔａ　ｏｆ　ｍｏｎｏｚｙｇｏｔｉｅ　ｔｗｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｍｏｔｈｅｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，　４６６：３３４－３３８．