VP2 灭活疫苗与HVT-IBD 载体疫苗免疫1 日龄商品白羽肉鸡后保护效果比较

试验研究 | Experimental researchＶＰ２灭活疫苗与ＨＶＴ－ＩＢＤ载体疫苗免疫１日龄商品白羽肉鸡后保护效果比较蒲兴1，杨慧明2，吴荣春1，党海斌1（1.勃林格殷格翰动物保健有限公司，上海 200040；2.中国农业大学畜禽疫病诊断研究中心，北京 100193）摘要：将55只1日龄商品白羽肉鸡分成5组，第1～3组为免疫组（每组10只），第4组为阳性对照组（攻毒不免疫10只），第5组为阴性对照组（不免疫不攻毒15只），1～3组分别免疫市场上含有IBDV VP2 蛋白的2种亚单位灭活疫苗（简称新流法）与HVT-IBD载体疫苗，21日龄使用IBDV强毒株BC6/85点眼攻毒，攻毒后4 d剖检记录法氏囊眼观病变和显微病变，以评估保护力；同时检测各组鸡只攻毒前后的VP2抗体进行分析。新流法免疫组攻毒后均有3/10的鸡出现法氏囊眼观病变，法氏囊病理评分分别为2.4和3.1，与阳性对照无明显差异，但明显高于HVT-IBD载体疫苗组（1/10法氏囊眼观病变，病理评分1.8分）；攻毒前（21日龄）各免疫组VP2抗体没有显著差异，攻毒后（25日龄）新流法免疫组的抗体都有明显下降。攻毒保护及血清学结果表明：与新流法灭活疫苗相比，HVT-IBD载体疫苗1日龄免疫商品白羽肉鸡后能提供更好的保护。关键词：法氏囊；HVT-IBD载体疫苗；亚单位疫苗；VP2；保护效力中图分类号：Ｓ８３１．５　　　　　文献标识码：Ｂ　　　　　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９６－３６３７．２０２０．２２．００１Comparison of Protective Efficacy between VP2 Inactivated Vaccine and HVT-IBD Vector Vaccine Administered to One-day Old Commercial White Broiler ChickensPu Xing1，Yang Huiming2，Wu Rongchun1，Dang Haibin1（1.Boehringer Ingelheim Animal Health Co.，Ltd，Shanghai 200040，China；2.Diagnosis and Research Center of Poultry and Livestock Infectious Disease of China Agriculture University，Beijing 100193，China）Abstract：55 day-old commercial white broiler chickens with high titer level of maternal IBD antibody were divided into 5 groups，group1～3 were vaccination groups，group 4 was challenge positive control，group 5 was negetive control．Vaccinated group 1～3 with two kinds of inactivited vaccines containing subunit IBDV-VP2 protein （named ND-H9-VP2 ） and HVT-IBD vector vaccine respectively．Challenged at 21 days post vaccination using the virulent IBDV strain BC6/85 via eye drop，all the birds were killed 4 days after challenge to record the gross lesion and histological examination score of the bursa to evaluate the protective effect．Blood samples were taken before and after challenge of each group to test the VP2 antibody．3/10 birds from two ND-H9-VP2 vaccine groups had gross lesion of the bursa，the histological score of this two groups were 2.4 and 3.1 respectively，which had no significant difference with the positive control group but were significantly higher than those in the HVT-IBD vaccine group（1/10 birds had gross lesion，histological score was 1.8） ．There was no signifacant difference in IBD-Plus antibody among three vaccinated groups before challenge（21 days old），while after challenge（25 days old） there was a significant decrease in VP2 antibody among the two subunit inactivited vaccine groups．The vaccination challenge protection and serological results showed that compared with the two kinds of inactivited subunit IBD-VP2 vaccines，the HVT-IBD vector vaccine can provide better protection against IBD when administered to the one-day old commercial white broiler chickens．Key words：fabricius bursa，HVT vector vaccine，subunit vaccine，VP2，protective effect0 引言传染性法氏囊病是鸡的一种高度接触性传染病，影响全球家禽生产。IBDV除造成鸡只死亡的直接损失外，还会引起免疫抑制，使鸡只对其他疫苗的免疫应答能力降低、对其他疾病的易感性增加、增重减缓和胴体废弃率增加，造成巨大的间接经济损失[1]。目前预防法氏囊病的疫苗主要有全病毒灭活疫苗、活疫苗、抗原抗体复合物疫苗、载体疫苗和亚单位疫苗。全病毒灭活疫苗通常用于种鸡以提供给下一代均匀的母源抗体，保护雏鸡抵抗早期感染。活疫苗的免疫效果受母源抗体影响，可能造成免疫失败或因毒力太强造成免疫抑制。抗原抗体复合物疫苗可突破母源抗体，用于1日龄雏鸡和作者简介：蒲兴（1987-），主要从事实验室诊断及田间兽医服务工作。2020.22·Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.1

Experimental research | 试验研究18日龄鸡胚免疫，但仍会造成免疫鸡只的法氏囊损伤。以HVT-IBD（VP2）为代表的载体疫苗因良好的安全性和保护效力而在全球广泛使用[2]。目前国内市场上还有用大肠杆菌表达的法氏囊VP2蛋白制成的多联灭活疫苗，如新城疫-禽流感（H9亚型）-传染性法氏囊病三联灭活疫苗，尽管这类产品标签上推荐的最早使用日龄为7～14日龄，但有些养殖户出于对人工成本及操作便捷性的考虑选择在孵化场免疫这类疫苗，其效果未知。本试验将市场上含有IBDV VP2蛋白的2种亚单位灭活疫苗与HVT-IBD载体疫苗分别免疫高母源抗体的1日龄商品白羽肉鸡，通过攻毒保护试验和血清学分析综合比较3种疫苗针对vIBDV BC6/85的保护效果，旨在为广大养殖户制定合理的IBD免疫程序提供参考。1.2.2 血清学检测采集第5组1日龄鸡只血液10份制备血清，用以检测母源VP2抗体。分别于21日龄和25日龄对第1、2、3和4组鸡只采集血液制备血清用以检测VP2抗体，每组每次采集10份。1.2.3 保护力评估1.2.3.1 临床观察攻毒后每日观察试验鸡，记录临床症状和各组试验鸡死亡情况。1.2.3.2 法氏囊眼观病变攻毒后4 d（96 h），处死各组鸡只并逐个观察/记录法氏囊病变（水肿、酪样分泌物和严重出血等）。1.2.3.3 法氏囊病理组织损伤评分1 材料与方法1.1 试验动物及材料1.1.1 试验动物攻毒后4 d（96 h），摘取各组鸡只的法氏囊，用10%中性甲醛固定后，常规石蜡切片，进行H.E染色，显微镜下观察，并进行病理评分。评分标准：1分，0～10%滤泡萎缩；2分，局灶性、轻度散在的细胞衰竭，10%～30%滤泡萎缩；3分，多病灶损伤，30%～70%滤泡萎缩；4分，大于70%的弥漫性滤泡萎缩和/或急性坏死[3]。1.2.4 数据统计与分析1日龄商品白羽肉鸡55只，购自北京某养殖场。1.1.2 试验疫苗HVT-IBD载体疫苗、ND+AI（H9）+IBD-VP2三联灭活疫苗（简称“新流法”）K1和K2。1.1.3 攻毒毒株IBDV强毒株BC6/85，购自中国兽医药品监察所。1.1.4 试剂盒试验数据以“平均值±标准差”表示，用SPSS Statistics 20软件进行数据分析处理，使用Duncan多重比较进行差异性显著检验，以P＜0.05作为显著性判断标准。IBD-Plus试剂盒，Synbiotics产品。1.1.5 隔离器饲养用隔离器：取得试验动物使用许可证书，许可证号为SXKY（京）2018-0038，由中国农业大学畜禽疫病诊断研究中心提供。1.2 方法1.2.1 试验设计2 结果与分析2.1 血清学检测2.1.1 VP2母源抗体1日龄鸡ELISA VP2抗体100%阳性，抗体效价为14 406.0±593.99（平均值±标准差）。2.1.2 免疫鸡只VP2抗体检测不同疫苗免疫1日龄商品白羽肉鸡后，于21日龄采血测定VP2抗体水平。各免疫组鸡只抗体均维持在较高水平，且无明显差异，但显著高于未免疫组。21日龄鸡感染IBDV-BC6/85株后，于25日龄测定VP2抗体水平，HVT-IBD载体疫苗免疫组与新流法灭活55只1日龄商品白羽肉鸡随机分为5组，1～4组每组10只，5组15只。1～3组分别对应颈部皮下免疫3种疫苗，0.2 mL/只。4、5组不免疫。21日龄时，除5组外，各组试验鸡用IBDV标准强毒BC6/85株点眼攻毒0.03 mL（含100 BID），各组隔离饲养。见表1。表1 动物处理及分组组别12免疫日龄11鸡只数量1010免疫疫苗、途径及剂量新流法灭活苗K1，皮下注射，0.2 mL/只新流法灭活苗K2，皮下注射，0.2 mL/只HVT-IBD载体疫苗（1dose），皮下注射，0.2 mL/只//攻毒日龄2121攻毒株、途径及剂量BC6/85，点眼，100 BIDBC6/85，点眼，100 BIDBC6/85，点眼，100 BIDBC6/85，点眼，100 BID/苗K1免疫组抗体水平相当，明显高于新流法灭活苗K2免疫组。除HVT-IBD载体疫苗免疫组外，新流法灭活苗K1、K2免疫组及阳性对照组抗体值较21日龄时有所降低，新流法灭活苗K2免疫组降低幅度（2 805.5）大于新流法灭活苗K1免疫组（1 447.2）。见表2。3110214511101521/注：“/”表示不进行操作。2 ·2020.22Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.试验研究 | Experimental research表2 免疫鸡VP2-ELISA抗体效价测定组别1234免疫疫苗21日龄（攻毒前）ELISA抗体效价抗体阳抗体ELISA抗体效价性率阳性率10/1010/1010/1010/106820.9±2288.17a10/104220.0±1762.80b9/106876.8±1853.41a10/102547.8±2044.49b9/10著低于攻毒对照组，新流法灭活苗K1、K2免疫组与攻毒对照组无明显差异，新流法灭活苗K2免疫组与空白对照组差异显著。见图1、图2。新流法灭8268.1±2263.35a活苗K1新流法灭7025.5±2176.55a活苗K2HVT-IBD6372.7±1823.98a载体疫苗/4629.4±1829.22b注：1.ELISA抗体效价以“平均值±标准差”表示；ELISA抗体效价≥999为阳性。2.同列数据肩标含相同字母表示差异不显著（P＞0.05），字母完全不同表示差异显著（P＜0.05）。图1 试验鸡（25日龄）法氏囊病理评分2.2 攻毒保护结果2.2.1 临床观察IBDV-BC6/85株感染21日龄试验鸡后，各组试验鸡只采食、饮水正常，未见明显临床表现。2.2.2 法氏囊眼观病变21日龄攻毒后4 d剖检试验鸡，观察法氏囊病变情况。剖检发现，第4组（攻毒对照）3只鸡法氏囊具有明显病变，表现为黄染、黏液；第1组（新流法灭活苗K1免疫）、第2组（新流法灭活苗K2免疫）和第3组（HVT-IBD载体疫苗免疫）法氏囊有明显病变的分别有3、3和1只，保护率分别为70%、70%和90%。见表3。 表3 不同疫苗对商品白羽肉鸡21日龄时IBDV攻毒的保护效果组别12345免疫疫苗新流法灭活苗K1新流法灭活苗K2HVT-IBD载体疫苗攻毒对照空白对照剖检病变计数3/103/101/103/100/15保护率（%）707090//图2 试验鸡（25日龄）法氏囊病理组织学图片（100×）A.新流法灭活苗K1免疫攻毒组；B.新流法灭活苗K2免疫攻毒组；C.HVT-IBD载体疫苗免疫攻毒组；D.攻毒对照；E.空白对照3 讨论IBD-VP2专用试剂盒又称IBD-Plus试剂盒，主要包被了法氏囊病毒的VP2蛋白，同时还有少量的VP3蛋白，常被用来评估HVT-IBD 载体疫苗或VP2亚单位疫苗的免疫抗体水平。本试验中，在免疫含有较高IBD母源抗体的1日龄商品白羽肉鸡后，21日龄HVT-IBD载体疫苗及2个VP2亚单位灭活苗免疫组抗体都呈阳性且明显高于对照组，这与BI公司新加坡产品发展中心在SPF鸡上的试验结果一致（数据未发表）。试验中K1、K2疫苗组攻毒后4 d（25日龄）抗体水平与攻毒前（21日龄）相比呈现下降，说明攻毒后血液中的部分抗体用于中和IBDV，这与母源抗体干扰早期疫苗免疫原理相同。与之相比HVT-IBD载体疫苗组的抗体在攻毒后4 d不降反升，这与载体HVT的广泛器官分布并持续表达VP2蛋白有关[4]。攻毒后4 d，无论法氏囊眼观病变还是显微病变，2个新流法疫苗免疫组都比HVT-IBD载体疫苗组严重，尤其是前者显微病变与攻毒对照组无显著差异，这与其在攻毒前的良好抗体表现不一致，说明体液免疫不是决定鸡只针对IBDV攻毒产生保护的唯一因素，不能直接将VP2抗体值的高低和保护力等同，与之前报道一致[5]。Jack等人在SPF鸡上评估HVT-IBD免疫效力的研究中发现，在免疫后10 d，即使鸡只的抗体不足或很低，但仍注：1. “/”表示无此项数据，数字“n/n”表示观察到的病变数及相关样品总数。2.以免疫攻毒鸡不出现法氏囊病特征性病变判为保护。2.2.3 法氏囊病理组织损伤评分21日龄攻毒后4 d逐只摘取法氏囊，甲醛固定后进行病理组织学评分。各免疫组鸡只感染IBDV-BC6/85株后法氏囊出现不同程度损伤，HVT-IBD载体疫苗免疫组法氏囊损伤程度（1.8分）低于新流法灭活苗K1免疫组（2.4分）和新流法灭活苗K2免疫组（3.1分）。统计学分析，HVT-IBD载体疫苗免疫组鸡只法氏囊损伤程度显2020.22·Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.3

Experimental research | 试验研究然能抵御IBDV的感染，这可能是由于HVT-IBD载体疫苗诱导细胞免疫所致[6]。细胞免疫在抗法氏囊病毒感染中起了非常重要的作用，T细胞可能参与对IBDV的杀灭过程，限制IBDV在法氏囊中的复制[7]。HVT在细胞内复制时可以诱导细胞免疫的产生，并产生持久的病毒血症[8]。法氏囊病毒的靶细胞是法氏囊内表达IgM的B细胞，IBDV一旦进入法氏囊内复制，法氏囊内表达IgM的B细胞数量迅速、显著下降，取而代之的是大量T细胞浸润和炎症反应，以及由此导致的法氏囊病理损伤，这也是法氏囊病毒造成鸡只免疫抑制的主要原因[9]。本试验中2个新流法疫苗免疫组攻毒后4 d的法氏囊病理损伤程度较HVT-IBD载体疫苗组严重，且与攻毒对照组没有显著差异，这预示BC6/85株的感染可能对鸡只造成严重的免疫抑制。对于商品白羽肉鸡群，感染IBDV后引起的免疫抑制会造成鸡只对其他疫苗的免疫应答降低、料肉比升高等一系列问题，进而造成间接的经济损失。IBDV可在鸡舍中长期稳定存在，因此除疫苗免疫外，空舍期彻底的清扫消毒及饲养期严格的生物安全措施也是法氏囊病综合防控的重要措施。in the Face of High-Titred Maternally Derived Antibody[J]．Journal of Comparative Pathology，2007，13（7）：81-84．[3] Sharma J M，Dohms J E，Metz A L．Comparative pathogenesis of serotype 1 and variant serotype 1 isolates of infectious bursal disease virus and their effect on humoral and cellular immune competence of specific-pathogen-free chickens[J]．Avian Diseases，1989，33（1）：112-124．[4] 朱佳．表达IBDVVP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗的构建及其免疫效力试验[D]．扬州：扬州大学，2015．[5] 赵起超，薛佳，张国中．两种鸡传染性法氏囊病疫苗免疫1日龄商品肉鸡的效果比较[J]．中国兽医杂志，2018（6）：107-110．[6] Gelb Jr J，Jackwood D J，Brannick E M，et al．Efficacy of recombinant HVT-IBD vaccines administered to broiler chicks from a single breeder flock at 30 and 60 weeks of age[J]．Avian diseases，2016，60（3）： 603-612． [7] Rautenschlein S，Yeh H Y，Sharma J M．The role of T cells in protection by an inactivated infectious bursal disease virus vaccine [J]．Veterinary immunology and immunopathology，2002，89（3）：159-167．[8] Tsukamoto K，Saito S，Saeki S，et al．Complete，long-lasting protection against lethal infectious bursal disease virus challenge by a single vaccination with an avian herpesvirus vector expressing VP2 antigens[J]．Journal of virology，2002，764 结论与新流法灭活疫苗相比，HVT-IBD载体疫苗1日龄免疫商品白羽肉鸡后能提供更好的保护。参考文献[1] Frederic J．Hoerr．Clinical Aspects of Immunosuppression in Poultry[J]．Avian Diseases，2010，54（1）：2-15．[2] M．Bublot，N．Pritchard，F．-X．Le Gros，et al．Use of a Vectored Vaccine against Infectious Bursal Disease of Chickens （11）： 5 637-5 645． [9] Käufer I，Weiss E．Significance of bursa of Fabricius as target organ in infectious bursal disease of chickens[J]．Infection and immunity，1980，27（2）： 364-367．4 ·2020.22Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.