痰培养标本的采集时间及频率

呼吸道标本的收集、送检和接种处理之马矢奏春创作

创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日 一、痰培养标本的收集时间及频率是什么?

1、在抗生素应用前收集痰标本。2、最好在清晨收集痰标本。多数患者在清晨痰较多，且含菌量也多，尤其是对平时痰量少的患者，清晨采痰相对容易。3、对于肺炎，如果能收集到比较理想的痰液时，建议一个检验周期(4天)内只送1次痰标本，不必连续送检，更不建议24小时内多次收集，除非痰液外观性状出现突然改变。4、怀疑分枝杆菌感染者，应连续收集3天清晨痰液送检。 二、痰标本的收集方法有哪些？

1、自然咳痰法：留取前刷牙，用清水漱口3 次(或硼酸漱口)，以除去口腔内大部分杂菌，之后先深吸气，再用力咳出呼吸道深部的痰液吐至一次性无菌痰怀(痰培养适用)或专用蜡浸小纸盒(抗酸杆菌涂片适用)内，盖好盖子。如果患者痰液较深，或者黏稠难于咳出时，可采取3%～5%的Nacl溶液(气道刺激高反应的患者如哮喘，不宜使用)、氯化铵溶液、N-乙酰-L-半胱氨酸溶液进行雾化吸入，以帮忙排痰，最佳痰液收集量为2～10m1，最低不克不及少于1ml。

2、特殊取痰法：由临床医生收集，根据方法的分歧，主要有：纤支镜抽吸法：纤维支气管镜检查可直接从肺部感染病灶获取支气管分泌物，操纵较为平安。用支气管镜可直接在病灶部位收集高浓度的感染病原菌，但也不克不及完全防止咽喉部正常菌群污

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染，防污染呵护套下收集的样本具有较大价值，经常使用的收集方法有：收集支气管肺泡灌洗(BAL)、经支气管镜直接吸引或用防污染样本毛刷收集!在欧美已将该方法采抜的标本作为替代金尺度力法(肺穿抽吸或活检)用呼吸道感染的诊断中经人气道吸引分泌物(ETA)：经人气道吸引是目前临床对不克不及自然咳痰的患者较为经常使用的力法。但由于气管插管等侵入性操纵，原有的天然屏障防御机制受到损害，以及长期平卧后气道分泌物的坠积损伤气管局部黏膜造成黏膜的自洁能力丧失，环境微生物。口腔菌群常下行定植下气管中而不再坚持无菌状态，所以此方法收集的标本同样会受到定植菌群的污染，也应该在培养前先做合格性筛查。经气管穿刺吸引物(transtrachealaspiration，TTA)：由于收集到的下呼吸道标本不受上呼吸道下常菌群的污染，曾较广泛推荐应用于下呼吸道细菌性感染的病原学诊断，尤其适合于厌氧菌培养。但此方法属于侵入性方法，患者比较痛苦，不容易接受。经胸壁针刺吸引物 (transthoracic needle aspiration, TNA) : 对于感染性疾病，法方法只用于诊断一些原因不明的肺炎(尤其在儿童)和免疫缺陷患者的肺炎，或贴近胸壁的肿块病灶的标本收集；胃内采痰法：清晨空腹时，将胃管拔出胃内，用注射器抽取胃液。适用于无自觉症状的肺结核患者尤其是婴幼儿(由于婴幼儿不会咳嗽，常将痰液存入胃中)，由于胃内痰液中的大多数细菌被胃酸杀死，而结核杆菌可抵抗胃酸，该样本比较适合作结核分枝杆菌培养。小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，用棉拭子

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伸入咽部，小儿因压舌刺激咳嗽可喷出痰液黏在拭子上，从而获得标本。或者先令患儿父母平坐于无扶手椅子上，将患儿头向左俯卧平放于父母的双腿上，医护人员用右手轻轻拍打患儿背部，左手打开痰杯盖子，持握痰杯的同时用手指轻轻按压其咽喉部天突穴处，刺激其咳嗽，由于俯卧，患儿无法将痰液吞下，只能从口中吐出，此时用痰杯顺手接住即可完成采样。 三、为什么痰标本收集前应进行口腔清洁

因为人体喉以上呼吸道黏膜概况及唾液中含有大量正常菌群；口腔卫生状态差者，以及老年、重症或住院患者的上呼吸道定植菌更多，致使途经口咽部咳出的痰常受到正常菌群和定植菌的污染，影响结果的判定，所以为了减少污染，收集痰液前需进行口腔清洁。

四、痰标本的运送、保管、验收和筛选 (1)痰标本运送和保管时应注意什么？

1、标本收集后需尽快(小于2小叫)送至实验室，运送延误可导致肺炎双球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌由于不适应外界环境和自溶现象而死亡;

2、延迟送检或待处理标本应置于10--20“C室温保管，既可防止苛养菌死亡，也能防止杂菌快速生长，保管时间不得超出24小时；

3、对可疑烈性呼吸道传染病(如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等)的患者检验标本，在收集、运送或保管过程中必须注意生物平安防

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护。

(2)如何验收筛选痰标本‘?

1、申请单填写应完整，条码清晰，标识唯一。容器内标本与申请单相符，收集时同在规定范围内。如果超出24小时应拒收。对侵入性操纵获取的标本，须与医生协商处理法子，并作记录。 2、标本容器必须符合规定，密闭无溢漏。否则拒收。

3、黄色、灰色、血性、铁锈色，浑浊、加厚，呈现团块状的标本为合格标本；而无色、白色、有黑色小点，不清晰，呈现泡沫状，有明显食物渣滓、纸屑灰尘、泥土的为分歧格标本，应拒收。

4、显微镜筛查，脓细胞＜10/HP或复层鳞状上皮＞25/LP的标本为分歧格标本，应退回。

5、所收集的标本类型与申请项不符合(如要求痰液的厌氧培养，未采取穿刺法取痰，未用注射器等厌氧装置运送；要求做痰培养却使用未灭菌的抗酸杆菌专用痰盒，等等)，应拒收。

6、同一患者同时送检多份痰液，或同一天送检多份申请项目相同的痰液，只选做其中质量较好的一份，其余痰液全部退回。 7、以培养为申请项目的痰液，当标本量少于1ml时，应拒收。 8、拒收与退回标本应详细填写拒收记录和反馈单(或者在信息系统上填写反馈并提交)。

下呼吸道感染标本中哪些不适合做厌氧培养哪些标本可以用于厌氧培养?为什么?

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1、易被口咽部分泌物污染的标本如咳痰、导痰、经口腔或鼻腔吸引的痰液、经人工气道吸引的分泌物和直接经纤支镜吸引的下呼吸道标本由于受到正常菌群中大量厌氧菌的污染，均不成用于厌氧培养。

2、防污染毛刷刷出物(PSB)、经气管穿刺吸引物(TTA)、经胸壁针刺吸引物(TNA)、开胸肺活检(0LB)组织标本，由于防止了上呼吸道正常菌群的污染和防止与氧气接触，可用于厌氧培养。 下呼吸道感染合格标本的特点有哪些？

一般认为，来自下呼吸道的合格标本应该是含脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，而受唾液污染严重的分歧格标本则来自颊黏膜的鳞状上皮细胞较多。

如何进行痰标本的合格性筛查?

痰标本留取后应先涂湿片，在不染色的状态下即可进行。将接种针前端5mm处折弯，曲成直角做成接种钩，挑取黄豆大小痰块，在载玻片上涂布开，使成(2×2)cm2大小的涂膜或者直接加(2×2)Cm2的盖玻片，轻压使痰块展开，放在显微镜下观察。根据《全国临床检验操纵规程》提供的尺度，鳞状上皮细胞＜10/LP，且白细胞＞25/LP者为合格痰标本。但经过实际观察对于自然咳痰收集的痰标本，白细胞≥25/HP(相当于≥100/LP)的痰标本与下呼吸道感染具有较高的一致性，可将一些具有渗出的非感染性的肺部疾患排除在外。而如果鳞状上皮细胞≥25/LP，说明标本可能仅仅是唾液或者被严重污染，应拒收。

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对于既有脓性成分，又有唾液成分的混合性痰标本如何处理? 先进行洗净，分离出脓性成分，再进行镜下筛选。如果脓性成分满足筛选条件，痰标本仍可使用；否则应弃去。

接种培养痰标本的预处理、涂片、染色、镜检，消化与接种培养 下呼吸道细菌学检验的标本进行细胞学和细菌学和显微镜检查的目的是什么？

1、下呼吸道标本涂片进行细胞学检查的主要目的是对送检标本进行质量评价，确认其是否应该进入下一步检验流程；其次，可初步判断标赋性质属于感染性还是肺感染性[例如单纯性未合并细菌感染的肺癌、硅沉着病(矽肺)、过敏性支气管炎、哮喘、支气管扩张等肺病的病理性痰液就属于非染性]。分析标本是否需要进行细菌培养。

2、下呼吸道标本涂片进行细菌学检査的主要目的是通过观察有无细菌，细菌的形态特征和染色特点，细菌的数量、分布，以及各种细菌与炎症渗出的白细胞之间的相互作用(吞噬、包裹、伴行)，分析判断标本中与感染相关的病原菌，将其与正常菌群或定植菌相鉴别，并根据形态特征推断其大致的种类，并有助于形态特殊微生物的快速诊断、有利于选择恰当的首代培养基。最重要的意义是痰涂片显微镜检验对整个痰培养流程起到决定性的导航作用，次日固体培养基上的菌落观察相结合，筛选出有意义的菌落进行下一步实验、决定痰培养陈述的最终准确性和临床符合率。

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(2)痰涂片湿片检查的目的是什么?

痰或下呼吸道标本的湿片检查可快速提供某些特殊的重要信息，尤其是对下呼吸道真菌感染(侵袭性曲霉菌感染、毛霉菌感染等)的快速诊断具有重要意义。方法：将痰液与10%KOH溶液为增强效果，推荐使用10%甘油水溶液配制)在载玻片混匀，盖上盖玻片，放到显微镜下暗视野观察。当标本中含有大量细胞碎片时，载玻片可在火焰上过一下，轻轻按压盖玻片使标天职散。当査见鹿角样分隔菌丝时提示曲霉菌感染，査见无分支或分支较少的无隔菌丝时可能为毛霉菌感染。

(3)为什么痰培养标本要进行洗净的预处理？如何处理? 由于于上呼吸道有大量正常菌群定植，除了侵入性操纵收集的标本(如PSB、TNA或TTA可避开上呼吸道正常菌群外，其他呼吸道标本如自然咳痰、支气管冲洗液、气道吸引痰等均不成防止地被口腔菌群污染，为防止太多菌群干扰检验，所与有需要对痰标本进行洗净处理。方法：在一次性痰杯中加入15～20ml灭菌生理盐水，剧烈振荡5～10秒(可使用振荡器的强挡)，然后用接种钩挑选出症液中的脓性部分，或将沉淀于杯底的脓痰小片钩出放入另一个无菌杯中，重复上述步调，如此洗涤2~ 3次，即可达到要求。 (4)如何制备一张尺度的痰涂片?

痰涂片对于痰培养的最终价值具有决定性意义，而制备好一张优秀的痰涂片对于染色，镜检都具有非常大的帮忙。

1、革兰染色：采取压片法制备薄涂片。方法：从洗涤后的痰液中

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挑取最具有代表性的脓痰小片或从脓痰块中最典型的部分切下一小块用于制片大小如绿豆，置于一张洁净载玻片的此侧端，左手持玻片于火焰或灭菌红外灯前微微加热，此时右手取另一张冷的载玻片“十”字交

叉，将痰块夹在两张玻片中间，按压使之充分展开，压住不要松开，向右侧缓慢匀速地拖动，即可完成一张痰涂片。如此，制备的涂片，薄而均匀，便于染色脱色，由于细胞充分展开，便于观察胞内吞噬现象。

2、抗酸染色：采取抹片法制备厚涂片。方法：使用去掉棉头的棉签断端挑取痰液的脓性部分在载玻片中央作画圆状涂抹，厚度以能透过涂膜，看清反面的文字为宜。 (5)如何染片和阅片?

1、经典染色方法各种教科书和各个版本的规程上都详细叙述。这里介绍经过本章节作者改良后的革兰染色方法，试剂使用书籍上介绍的经典革兰染色液，将碘液改为Albert碘液对倍稀释，脱色液使用3：7(v/v)的丙酮酒精溶液，复染液改为1：5(v/v)稀释的碳酸复红。染色过程：滴加结晶紫染色液覆盖涂片染色1分钟，蒸馏水冲洗；甩掉多余水滴，滴加碘液覆盖涂片1～2分钟媒染(室温低于20℃时作相应延长)，蒸馏水冲洗；甩掉多余水滴，滴加丙酮酒精液脱色时，需不竭晃动玻片，使液体迅速均匀覆盖涂片，1～2秒后倒掉，不冲洗，再次滴加脱色液，晃动覆盖，脱色3～4秒后倒掉，仍不冲洗，又滴加脱色液进行第三次脱色，此时

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缓慢晃动玻片，脱色4～6秒后蒸馏水冲洗；甩掉多余水滴，滴加稀释复红，晃动玻片混匀染液后覆盖涂片复染1分钟用蒸馏水冲洗，自然干燥或滤纸吸干后上油镜。

目前，各种商品化染色液层见叠出，质量良莠不齐，配方均进行了分歧程度的改动，其说明

书要求的染色操纵流程各不相同。然而，为了达到最佳染色效果，使用新厂家的染色液时多必须进行流程摸索。除了使用混合菌进行质控以外，还应该使用痰涂片、脓液涂片、血涂片，以及粪便涂片进行实际染色效果验证，找出一个最佳染色流程。流程确定后，微生物室所有成员必须严格执行该流程，不允许任意改动。

2、痰涂片阅片能力的培养，是一项逐渐积累的过程，需要经过长年累月反复的强化训练才干造就。良好的训练方案应将阅片与次日的菌落观察相结合，逐渐建立起理性认识。另外，由于痰涂片中的细菌经过抗生素和人体免疫因子(白细胞溶酶、补体、抗体)的影响后，其形态与对数期纯培养物不太一致，需要总结各种罕见细菌的形态变异特点。使用药敏试验中出于亚抑制状态下的细菌涂片染色镜检能快速总结经验。所谓亚抑制状态细菌即是指，处于抑菌环边沿或比MIC低一个梯度浓度孔中的细菌。

阅片技巧：1、先在低倍镜下寻找适合阅片的区域，该区域脓细胞呈团块状分布，集中而不稠密，且周围无鳞状上皮细胞或无大量呈团状分布的细菌球。

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2、认真搜寻脓细胞胞质中有无吞噬的细菌或真菌孢子，注意细菌/真菌的染色排列特征(如成双、链状、并行、分枝、葡萄状、放射状、文字形、栅栏状、条索状等)，菌体特征(如大小、粗细、长短、扭曲)；有无真菌菌丝团块或者放线菌菌丝被结节状分布的炎性细胞包裹。3、区别吞噬与黏附的方法：位于细胞核上的细菌为黏附；细菌与细胞核不在同一层面上的为黏附；多种分歧形态和染色特征的细菌纠结成球状者为黏附；链球菌同一条链，部分在细胞上，部分在细胞外时为黏附；真菌在脓细胞中未发生占位现象的为黏附；革兰阳性细菌染色深浅与胞外菌完全相同时考虑为黏附。胞内菌体周围有一圈微弱狭窄淡染区的为吞噬；由于细胞的位阻效应导致胞内菌染色相对于胞外角偏淡，加之受溶酶体的破坏，胞内G‘细菌染色呈现班驳不均现象；胞内G杆菌菌体具有膨大趋势；真菌孢子会将细胞核挤到细胞的边沿，形成月牙形。

4、观察细菌与细胞分布的相关性，假如某种形态的细菌在片中，细菌多的地方细胞少，而细胞多的地方细菌少，那么这种形态的细菌多为定植菌；反之即使没有吞噬，也应考虑为感染菌；对于产荚膜的细菌，吞噬现象的观察比较困难，采取分布相关性(即伴行行为)比较容易找到感染菌。另外，对于发生荚膜的细菌，只要认真搜寻，荚膜低表达或荚膜丢失的菌体，也能在胞内发现。 5、丝状真菌和诺卡菌以及其他放线菌由于菌体较大，其发生的炎性反应为包裹显现，即真菌菌丝团块或者丁放线菌菌丝被结节状

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分布的大量炎性细胞包裹。

6、特殊细菌的识别：流感杆菌在脓细胞内为G-细小杆菌，灰尘样分布，往往一个细胞中吞噬大量的细菌；卡他莫拉菌(以及其他莫拉菌)为G-双球菌，胞外细菌量大，而胞外菌分布较少，且无荚膜；鲍曼不动杆菌为G-球杆菌，眼镜形，由于产荚膜，其分布特点是胞内菌较胞外菌少；金黄色葡萄球菌在痰涂片中容易识别，胞内成对或葡萄状排列，染色比胞外菌偏淡；铜绿假单胞菌为G-细而刚直的杆菌，散在排列；黏液性铜绿则在胞外形成明显淡染的黏液层，大量细菌聚集成片状分布；肺炎克雷伯菌为G-粗大杆菌，成对排列，胞外菌多有厚重荚膜；其他肠杆菌科细菌及气单胞菌为G-规则杆菌，形态与大肠埃希菌类似；肺炎链

球菌为G-矛尖状双球菌，胞外菌有厚重荚膜，而胞内菌染色偏淡且班驳不清，容易漏诊；嗜麦芽寡养単胞菌为G-细长杆菌，并行排列形成筷子样，菌体往往有弯曲；化脓性链球菌在涂片中为G+长链状排列的球菌，菌体为正圆形，比葡萄球菌小，咆内菌染色偏淡，易出现班驳。隐球菌在校涂片中为G-大球形真菌孢子，周围向不着色的荚膜，在涂片中染色

较淡，易漏诊，咆内菌着色班驳，或形成不看色的球形空泡，在细胞内具明显的占位，细胞核被排挤到边沿形成月牙形。 (6)为什么痰培养标本要进行均质化的预处理？ 如何处理?

答：一般情况下病原菌感染肺部，其部位在下呼吸道深部，炎性

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渗出物为了将炎症局限，病原菌被包裹在其中，由于肺属于与外界环境单向相通的脏器，渗出的病理产品不容易及时排出，感染灶中炎症渗出物反复包裹，层层叠叠，病原菌往往位于包裹物的最里层，位于脓细胞胞质中。若直接接种于培养基上，包裹物中有价值的细菌很难突破包裹在培养基上生长，而痰的均质化有助于包裹物内部细菌的流露，可提高感染菌的阳性检出率。

方法：痰均质化法以胰酶均质化为多见。其方法为：在盛装痰标本的容器中加入等量用无菌P7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)配制的l%的胰蛋白酶溶液，放置35℃培养箱内消化90分钟即能使痰液均质化，而对细菌培养无影响。另外，可使用无菌生理盐水代替灭菌PBS，但消化效能较低，需要延长消化时间至120分钟。此外，还可用玻璃组织研磨器。

(7)痰标本培养是否可用肉汤增菌或高选择性培养基?为什么? 答：不主张采取肉汤増菌或高选择性培养基等极端的方法。因为肉汤増菌后与感染不相关的细菌也一同增殖，很多时候与感染不相关的污染菌生长速度大于H标细菌，导致目标细菌由于竞争抑制而无法分离。再则，增菌后标本的原始状态发生改变，最终导致培养结果无法代表患者体内的真实状态，使痰培养失去应有的诊断价值。而高选择性培养基则又是另一个极端。由于导致肺部感染的细菌多种多样，目的菌经常未知，进行痰培养时，我们的分离目的其实不明确，采取高选择性培养基将会因为培养基的选择性过强而抑制真正有价值的微生物，导致严重的漏诊。因而高

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选择性培养基在痰培养中不常使用。除非是有目的性地选择分离某些特定的微生，例如嗜肺军团菌。

(8)痰标天职离培养基的选择、接种及培养结果分析(菌落观察)如何进行?

答：1、一般细菌培养应同时划区接种：血平板：适用于分离肺炎链球菌和其他细菌。加抗生素的巧克力平板：适用于分离嗜血杆菌。麦康凯/中国蓝平板：适用于分离革兰阴性杆菌；CHROMagar或含抗毒素的SDA：适合于分离曲毒菌、毛霉菌或者罕见感染的酵母样真菌，如隐球菌。

2、分离培养：血平板和巧克力平板置于5%CO2环境，麦康凯平板中国蓝平板置大气环境，于35℃孵育；而CHROMagar 或含氯霉素的SDA置28℃，高湿度（＞70%）环境下培养。

3、与涂片镜检结果相结合，挑取菌落形态与涂片中胞内菌或位于包裹物中的细菌形态一致的可疑菌落进行细菌鉴定和药敏试验——注意：对于菌落数较少，或者菌落体积较小的细菌，需要首先进行传代纯培养。

4、综合细菌在分歧培养基上的生长情况，快速定位和判断细菌大致的种类，并根据情况决定选用哪一种培养基上的菌落进行下一步试验。如此，既可大大节省时间，又能少走弯路，防止一些低级错误的发生。

值得注意的是，痰及下呼吸道分泌物标本易受到上呼吸道正常菌群的污染，临床微生物学实验室通常可从送检的呼吸道标本中分

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离出多种细菌，但分离细菌是否就是下呼吸道感染的病原菌，这对临床诊断与治疗至关重要。实验室人员必须重视这个问题，做到每个环节有理有据，环环相扣，形成严密的证据链条，以包管我们出具的痰培养结果的可靠性。

在实际工作中，由于痰液中细菌生长速度纷歧，如肺炎链球菌、卡他莫拉菌可能被快速生长的细菌(包含正常菌群)所掩盖，如不仔细观察就会造成漏诊。这就要求实验室人员必须具备一定的菌落形态积累，能准确识别受到抑制的不太典型的菌落。 (9)痰培养结果如何陈述更科学?

答：由于检验结果陈述的时效性，下呼吸道标本细菌学检验结果分为初步和最终结果陈述。1、初步陈述：主要是涂片陈述：内容主要有，未染色标本直接涂片结果(有无脓细胞、脓细胞数量、上皮细胞数量、有无真菌菌丝、有无寄生虫等)、革兰染色镜检结果(包含脓细胞数量、上皮细胞与胞外正常菌群数量与污染程度、脓细胞胞内吞噬细菌/真菌孢子的情况，炎性包裹物内细菌和真菌的存在情况，脓细胞或炎性包裹物内的细菌/真菌的染色特征、形态特征和排列特征等。

2、最终结果陈述：除了上述涂片陈述外，还包含所分离细菌的鉴定结果、耐药监测结果、一般药敏结果与弥补药敏结果、该检验结果与临床诊断和治疗相关性的评述和建议。

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