临床与实验病理学杂志J Clin Exp Pathol 2017 May;33(5) ・525・ 网络出版时间:2017—5—17 23:53 网络出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R。20170517.2352.012.htm1 非小细胞肺癌中磷酸化FRK蛋白的表达及预后分析 李丽 ,寇玉玲 ,陈菲 ,孙兴旺 摘要:目的探讨非小细胞肺癌(non—small cell lung cancer,NSCLC)中磷酸化FRK(phospho—FRK,p-FRK)蛋白的表达及其预 后分析。方法 应用免疫组化EnVision两步法检测162例NSCLC组织及其远端对照组织中p-FRK蛋白的表达水平,并分析 p-FRK蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征的相关性,评价p-FRK在NSCLC患者预后中的价值。结果p-FRK蛋白在 NSCLC中的阳性率明显高于远端对照组织(51.9% 11.7%,P=0.001)。p-FRK蛋白阳性水平与NSCLC病理组织类型、淋 巴结转移、pTNM分期均显著相关(P<0.05)。Kaplan—Meier生存分析显示p-FRK表达水平与患者术后总生存率呈负相关(x =17.849,P<0.001)。多因素生存分析显示p-FRK蛋白是NSCLC患者术后不良预后的预测因素(HR=0.496,95%C/: 0.295—0.836,P<0.05)。结论中图分类号:R 734.2 p-FRK阳性患者预后较差,有望成为NSCLC患者预后判断的新型标志物。 文章编号:1001—7399(2017)05—0525—05 关键词:肺肿瘤;非小细胞肺癌;Src激酶家族;p-FRK;预后 文献标志码:A doi:10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.012 肺癌发病率与病死率在我国恶性肿瘤中均居首 位,在男性及女性中的病死率分别为29.5%和 22.5%…。肺癌分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung 1材料与方法 1.1材料收集华西医院2007年1月~2007年 12月病理科确诊为NSCLC且患者术前均未行放、 cancer,SCLC),其中8O%~85%肺癌为NSCLC, NSCLC进一步分为3个病理组织学亚型:腺癌 化疗及免疫治疗的石蜡标本162例。其中男性116 例,女性46例,最小年龄34岁,最大年龄81岁,中 位年龄60岁。按照第7版国际抗癌组织联盟 (UICC)的NSCLC分期标准:61例I期、38例Ⅱ期、 53例Ⅲ期、lO例Ⅳ期,其中9l例腺癌、7l例鳞癌。 本组标本均通过华西医院伦理委员会批准,且患者 签署书面知情同意书。162例NSCLC组织及其远 端对照组织均行石蜡切片HE染色,并由两位病理 医师分别确认病理组织学类型。 1.2试剂一抗为兔抗人p-FRK抗体,购自Bea. comBio公司(BIO100431),工作液稀释比例1:100; 抗体稀释液(¥2022,DAKO,丹麦);二抗为山羊抗 兔/鼠IgG/HRP(K500711,DAKO,丹麦);50x抗原 (30%~40%)、鳞癌(20%~25%)和大细胞癌 (15%~20%) J。尽管肺癌的诊断及治疗水平不 断发展,但其5年生存率仅为17% ,所以寻找肺 癌发生、发展及对治疗有价值的蛋白尤为重要。近 年研究发现,Src激酶家族可通过影响肿瘤细胞的增 殖、分化、迁移、黏附和凋亡,从而在肿瘤的发生、发 展、转移中起重要作用_4 J。随着研究的不断深入, 发现Src激酶家族中FRK(fyn—related kinase)在不同 类型肿瘤中发挥促进或抑制肿瘤生长的作用 " 。 但磷酸化FRK(phospho.FRK,P-FRK)蛋白在 NSCLC肿瘤组织中的表达尚未见报道。本文收集 162例肺癌标本及其远端对照组织,采用免疫组En- Vision两步法检测两组中p-FRK表达强度差异,并 分析其与NSCLC临床病理特征及预后的相关性。 修复液(EGTA组织抗原修复液,MVS-O080,福州迈 新公司);Super PAP Pen超级免疫组化油笔(PEN一 0002,福州迈新公司);Harris苏木精(7211,Thermo, 美国)。 1.3免疫组化免疫组化染色采用EnVision两步 法。石蜡标本连续4 Ixm厚切片,60℃烤箱烤片2 接受日期:2017—03—22 作者单位: 西南医科大学附属医院病理科,泸州四川大学华西医院病理研究室,成都作者简介:李646000 610041 h,37℃烤箱烤片过夜,二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱二 甲苯至流水冲洗切片,EGTA(pH 9.0)抗原修复液 98℃水浴修复30 min,3%H O:溶液阻断内源性过 氧化物酶室温15 min,滴加100~200 L的p-FRK 丽,女,硕士研究生。Tel:(028)85164170,E—mail lilymc@163.con 孙兴旺,男,教授,通讯作者。E-mail:lysunxw@163.con (1:100),4℃孵育过夜,室温复温30 min,滴加100 ・526‘ 临床与实验病理学杂志.,Clin Exp Pathol 2017 May;33(5) ~200 txI K500711试剂盒内的多聚物酶标二抗(即 用型),37 孵育45 min,孵育完毕,DAB在显微镜 下控制显色,Ha ̄wis苏木精复染3 rain,流水冲洗返 蓝,梯度乙醇脱水、二甲苯透明2次,Clearvue封片 机完成封固,Olympus BX51显微镜下观察。每一批 次免疫组化实验均设置阴性对照,阴性对照用PBS 代替一抗。 1.4结果判定p-FRK蛋白阳性定位于细胞胞质, 免疫组化结果由两位病理医师阅片进行判断 根据细胞着色程度和阳性细胞占所观察细胞百分比 的评分乘积进行半定量,随机选择200倍视野下l0 个无交叉重复的视野,且每个视野下计数l00个肿 瘤细胞,按细胞着色程度评分:无阳性着色为0分, 浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色计为3分。按 阳性细胞所占观察细胞百分比评分:无阳性细胞为 0分,≤20%为1分,2l%~49%为2分,i>50%为3 分。将每一张切片的两项分值相乘:0为阴性(一), 1~3为弱阳性(+),4~6为中度阳性(++),>6为 强阳性(卅)。统计分析时将(一)定义为蛋白阴性, (+~卅)定义为蛋白阳性 1.5随访。 对162例NSCLC患者进行电话或定期 图1 A.肺腺癌tf】p-FRK呈刚性,EnVision 步法:B.肺鳞癌『I1 P— FRK呈阳性,EnVision两步法 2.2 P-FRK表达与NSCLC临床病理特征的相关性 162例NSCI C中,p-FRK表达与肿瘤大小有关,1、2 + +rr4组p-FRK的阳性率明显高于Tl组,组问比 较差异有统计学意义(P<0.05);p-FRK蛋白表达水 门诊、复诊随访。随访从手术之日开始,失访、死于 其他疾病或在随访时仍存活视为截尾数据。总生存 期定义为从第一次确诊开始至死亡或随访终点时 间。 平在淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组(尸< 0.05);临床分期Ⅲ+Ⅳ期组p-FRK蛋白表达水平明 显高于I+Ⅱ期患者(P<0.05)。p-FRK表达 j患者性 别、年龄均无相关性(P>0.05,表1)。 表1 p-FRK表达与NSCI C临床病理特征的相关性 1.6统计学方法所有数据应用SPSS 22.0软件 进行统计学处理,采用x 检验及Fisher精确检验进 行率的比较分析;生存率采用Kaplan—Meier法分析 统计;采用Log—rank检验分析各变量与预后的关系; 采用Cox回归模型进行多因素分析。P<0.05为差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 NSCLC及远端组织中P-FRK的表达 NSCLC肿瘤组织中p-FRK阳性定位于细胞质,呈棕 黄色弥漫性或颗粒状着色;远端组织中肺泡上皮细 胞、终末细支气管上皮细胞均无明显p-FRK阳性着 色,仅少量细胞问质着色,阳性着色程度及阳性细胞 百分比明显低于肿瘤组织。NSCLC肿瘤组织中P— FRK蛋白阳性率明显高于远端组织(5I.9%US l1.7%,x =10.556,P=0.001),两组间差异有统计 学意义。在162例NSCLC中,p-FRK在腺癌中阳性 率高于鳞癌(59.3% 42.3%,x =4.664,P= 0.031),差异有统计学意义(图1)。 临床与实验病理学杂志J Clin Exp Pathol 2017 May;33(5) ∞ ∞加∞如∞如加m 0 ・527・ ∞ 鲫 印∞们如加2.3 P-FRK表达与NSCLC患者生存时间的关系 表3多因素Cox比例风险模型分析NSCLC患者 应用Kaplan-Meier法对162例NSCLC患者进行生存 分析,结果显示:患者总生存期为1—63个月,中位生 存期为12个月;患者1—5年生存率分别为85.7%、 57.1%、35.4%、19.4%、2.3%(图2)。p-FRK阳性组 总生存期及预后风险因素 与p-FRK阴性组间生存率差异有统计学意义(x = 17.849,P<0.001,图3)。采用Cox风险比例模型,将 患者性别、年龄、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、P. 3讨论 TNM分期、p-FRK表达均纳人分析。单因素分析结 果发现:p-FRK表达、p-TNM分期、淋巴结转移与 NSCLC患者术后生存率有显著相关性(P<0.001,表 2)。将单因素分析中对患者生存率有显著影响的P. FRK表达、p-TNM分期、淋巴结转移因素纳入Cox回 归模型,进行多因素分析结果发现:p-FRK表达是肺 癌患者预后的影响因素(P<0.01,表3)。 斟 灶 总生存期(月) 图2 NSCLC的总生存期曲线 斛 灶 0 12 24 36 48 60 总生存期(月) 图3 p-FRK阴性组与阳性组的总生存期曲线 表2单因素Cox比例风险模型分析NSCLC患者 总生存期及预后风险因素 非受体酪氨酸激酶Src激酶家族有13种,在人 基因组中由Blk、Brk、Fgr、FRK、Fyn、Hck、Lck、Lyn、 Src、Srm和Yes共11个成员组成_5 J。近年多项研究 表明Src激酶家族在多种信号转导通路中有关键性 作用,参与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、黏附和凋 亡,与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关 I9 J。 近年研究发现FRK在不同的肿瘤中扮演不同角色, 在肝癌和胰腺癌中FRK高表达可促进癌细胞侵 袭 1 “J,在脑胶质瘤中FRK抑制肿瘤的生 长_l 。本组发现FRK中的P.FRK在NSCLC中 高表达,推测其在肺癌发生、发展中有重要作用。 随着对肿瘤研究的不断深入,许多与肿瘤预后 相关的Src激酶家族也相继被发现。Roseweir等 6_ 报道Lyn核表达的肾透明细胞癌患者预后不良,且 Lyn可作为肾透明细胞癌患者预后评估的预测因 子。Windischhofer等 发现Src蛋白参与G(a1)/ Src/ ̄2/44/MAPK信号通路可诱导早期生长反应 因子一1(Egr.1)表达,促进骨肉瘤MG-63细胞株的发 生、发展。于涓翰等 等实验结果显示Brk与Ki- 67的协同表达是促进NSCLC进展的重要因素。目 前,已发现的Src家族成员多数是癌基因,促进肿瘤 发生、发展。 FRK是Src家族激酶中的一员,Zhou等¨ 发现 FRK在人胶质瘤组织中的表达水平与其恶性程度 呈负相关,过表达FRK可以抑制胶质瘤细胞的迁移 与侵袭能力。Yim等 报道FRK有抑制乳腺癌细 胞生长的作用;但Chen等 。。发现FRK是肝癌细胞 侵袭的正因子,促进肿瘤生长;提示在不同肿瘤 中FRK所起的作用也不相同。目前,p-FRK与 NSCLC的关系国内外尚无相关报道。本组结果显 示,p-FRK表达定位于NSCLC肿瘤细胞细胞质而非 细胞核,p-FRK在远端对照组织中的表达水平远低 于其在NSCLC组织中表达水平,p-FRK在肺腺癌中 的阳性率高于肺鳞癌。 淋巴结转移是肺癌患者重要的转移方式之一, 通常与患者的不良预后密切相关。本组结果发现, ・528・ 临床与实验病理学杂志J Clin Exp Pathol 2017 May;33(5) Cancer Cell,2009,15(4):304—314. 淋巴结转移者p-FRK蛋白表达水平明显高于无淋 巴结转移者;本实验结果还发现,NSCLC患者P— FRK表达水平与患者p-TNM分期呈明显的正相关 (P<0.05),提示p-FRK阳性程度可能与NSCLC患 者的不良预后相关。 [6] Wang R,Li H,Guo X,et a1.IGF-I induces epithelial-to—mesen— chymal transition via the IGF--IR・・Src--MicroRNA--30a・・E--Cadherin pathway in nasopharyngeal carcinoma cells[J].Oncol Res,2016, 24(4):225—231. [7] Meng Y,Shukla D,Pande V S,et a1.Transition path theory a- 本组中p-FRK阳性程度与NSCLC患者生存周 期明显相关。p-FRK阴性组的中位生存期及5年生 存率均高于阳性组,推测在NSCLC发生、发展中P- FRK可能起重要作用,但其机制尚需进一步分析。 Cox回归单因素分析发现,p-FRK表达、淋巴结转 nalysis of c—Src kinase activation[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2016,113(33):9193—9198. [8]Wang Y D,Bao x Q,Xu S,et a1.A novel parkinson’s disease drug candidate with potent anti—neuminnammatofy effects through the Src signaling pathway[J].J Med Chem,2016,59(19):9062 9079. 移、p-TNM分期均对NSCLC患者术后生存率影响显 著,提示p-FRK表达可能作为NSCLC患者预后的 影响因素。将淋巴结转移、p-TNM分期、p-FRK表 达水平均纳入Cox回归模型进行多因素统计分析, 结果发现p-FRK表达(P<0.01)是NSCLC患者预 [9 J Mila D,Calderon A,Baldwin A T,et a1.Asymmetirc Wnt path— way signaling facilitates stem cell—like divisions via the nonreceptor tyrosine kinase FRK一1 in caenorhabditis elegans[J].Genetics, 2015,201(3):1047—1060. [10]Chen J S,Hung W S,Chan H H,et a1.In silico identification of oncogenic potential of fyn・・related kinase in hepatocellular carcino-- 后的影响因素,提示p-FRK可能成为判断 NSCLC患者不良预后的标志物之一。 综上所述,p-FRK在NSCLC中的表达水平明显 ula[J].Bioinfomatrics,2013,29(4):420—427. [11]Je D W,O Y M,Ji Y G,et a1.The inhibition of SRC family ki— nase suppresses pancreatic cancer cell proliferation,migration, and invasion[J].Pancreas,2014,43(5):768—776. [12]Zhou X,Hua L,Zhang W,et a1.FRK controls migration and in. vasion of human glioma cells by regulating JNK/c-Junsignaling 升高,且阳性程度与淋巴结转移及生存周期有明显 的相关性,表明p-FRK可作为NSCLC患者不良预 后的预测因子,且有望成为肺癌病理诊断中新 l Jj.J Neurooncol,2012,110(1):9—19. 的分子标志物。但是NSCLC的发生、发展是多种因 素共同产生的结果,p-FRK在NSCLC的发生及转移 中的生物学机制仍需进一步探讨。 参考文献: 陈万青,郑荣寿,张思维,等.2012年中国恶性肿瘤发病和死 亡分析[J].中国肿瘤,2016,25(1):1—8. avis W D,Brambilla E,Riely G J.New pathologic classiflca. [2] Trtion of lung cancer:relevance for clinical practice and clinical tri. [13]Shi Q,Song X,Wang J,et a1.FRK inhibits migration and inva— sion of human glioma cells by promoting N--cadherin/ ̄-・catenin complex fomlation[J].J Mol Neurosci,2015,55(1):32—41. [】4]Chen B,ZhangW,Gao J,et a1.Downregulation of ribosomal pro, tein S6 inhibits the growth of non—small cell lung cancer by indu. cing cellcycle arrest,rather than apoptosis[J].Cancer Lett, 2014,354(2):378—389. [15]王志维,雷珍牛,林辉,等.119例非小细胞肺癌中CCR9的 表达及其预后分析[J].临床与实验病理学杂志,2015,31 (7):764—768. a1s[J].J Clin Oncol,2013,3l(8):992—1001 [3] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics『J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11—30. [16]Roseweir A K,Qayyum T,Lim Z,et a1.Nuclear expression of Lyn,a Src family kinase member.is associated with poor progno— sis in renal cancerpatients[J].BMC Cancer,2016,16:229. .[4] Senda Y,Murata—Kamiya N.Hatakeyama MC—terminal Src ki. 1 17]Windischhofer W,Huber E,Rossmann C,et a1.LPA.induced suppression of periostin in human osteosarcoma cells is mediated by nase—mediated EPIYA phosphorylation of pragmin creates a feed. forward C—terminal Srckinase activation loop that promotes ce11 m0. the LPA(1)/Egr-l axis[J].BMC Cancer,2012,94(9):1997 tility[J].Cancer Sci,2016,107(7):972—980. [5] Yim E K,Peng G,Dai H,et a1Rak functions as a tumor sup. .2005. [18]于涓翰,张勇,刘洋,等.Brk在非小细胞肺癌中的表达及 pressor by regulating PTEN protein stability and function[J]. Ki67表达的关系[J].解剖科学进展,2013,19(1):9—12. Expression of p-FRK and its prognostic analysis in non・small cell lung cancer patients LI Li ,KOU Yu—ling ,CHEN Fei ,SUN Xing—wang ( Department of Path。logy,Afilfiated Hospital of Southwes Medical Unive ity,Luzho 646000.Chin。: 。Lab。ratory ofPath0logy,West China HospitalSichuan University,Cheng ,610041,China) ABSTRACT Purpose To investigate the expression of P— and to explore its prognostic value. Methods The expression of FRK protein in non—small cell lung cancer(NSCLC)patients p-FRK protein in tumor tissues and corresponding adjacent 临床与实验病理学杂志J Clin Exp Pathol 2017 May;33(5) ・529・ 网络出版时间:2017—5—17 23:53 网络出版地址:http://kns.cnki.net/kems/detail/34.1073.R.20170517.2352013.htm1 .良性转移性平滑肌瘤6例临床病理分析 赵利敏 ,江若霞 ,李摘要:目的姗 ,桂秋萍 ,王志永 ,杨元元 探讨良性转移性平滑肌瘤(benign metastasizing leiomyoma,BML)的临床病理学特征、诊断及鉴别诊断。方法 收 集6例BML患者的临床病理资料,采用HE及免疫组化EnVision法染色进行组织学观察。结果6例患者均为女性,年龄 33~65岁,均有子宫肌瘤手术史;5例为肺转移,其中伴腹壁转移、伴脊柱转移各1例,另1例为腹股沟转移;镜下为梭形细胞 肿瘤,部分病例富于细胞,细胞异型性小,未见明显核象及坏死。免疫表型:SMA、sM—MHC、desmin,vimentin,ER、PR均阳 性,S-100、CDll7、CD34均阴性,Kj一67增殖指数均小于5%;随访患者3例带瘤生存、3例无瘤生存,分别随访18、28、4O、3l、36、 80个月。结论BML多发于子宫平滑肌瘤手术史的女性患者,肺是其常见转移部位,常同时伴其它部位的转移,病情进展较 缓慢,大多数患者生存期较长。 关键词:子宫平滑肌瘤;转移;临床病理;鉴别诊断;组织来源 中图分类号:R 737.33 文献标志码:A 文章编号:1001—7399(2017)05—0529—05 doi:10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.013 良性转移性平滑肌瘤(benign metastasizing leio— myoma,BML)是子宫外出现的以良性形态为特征 的平滑肌瘤,常有子宫平滑肌瘤或子宫平滑肌瘤手 术史,多发于育龄期女性。文献报道以肺脏转移多 医师的诊断、治疗及判断预后等提供参考。 1材料与方法 1.1材料收集2008~2015年总医院病理 见,还可出现皮肤、淋巴结、脊柱、肌肉组织、心脏等 部位的转移¨J。目前有关其发病机制及生物学行 为仍存在争议,文献报道多以个案为主,本文现收集 科诊断的6例BML临床资料及手术标本,对其进行 复查,包括患者年龄、性别、病史、临床表现、影像学 特征、转移部位、治疗及随访。 总医院病理科诊断的6例BML,结合临床病 理特征、鉴别诊断及治疗等进行分析,为临床和病理 接受Et期:2017—03—16 作者单位:。郑州市第一人民医院病理科450004 451191 1.2方法标本采用10%中性固定,常规 脱水,石蜡包埋,4 m厚切片,HE染色,光镜观察。 免疫组化采用EnVision法,一抗ER、PR、Ki-67、vim- entin、desmin、SMA、S.100、CD117、SM.MHC、CD34均 购自北京中杉金桥公司。所用抗体均为工作浓度,具 体操作步骤按试剂盒说明书进行。用已知阳性病例 作为阳性对照,阴性对照用PBS代替一抗。 1.3结果判定ER、PR、Ki一67表达定位于细胞核, 呈棕黄色颗粒状;SMA、vimentin、desmin、s-100、 CD1 17、SM.MHC、CD34表达均定位于细胞质,呈棕 河南医学高等专科学校医学系,郑州河南中医药大学病理学与病理生理学教研室,郑州 450016 总医院病理科,北京100853 作者简介:赵利敏,女,硕士,主治医师。E—mail:y100104002@126 normal pulmonary tissues from 162 NSCLC patients was detected by immunohistochemistry of EnVision two—step.The correlation among p-FRK expression,age,gender,clinicopathologic fea— tures,pTNM stage and metastasis of NSCLC patients was also analyzed.whether p-FRK could be used as an independent pre- 0.05).Kaplan—Meier survival analysis showed that there was a negative correlation between p-FRK positive rate and postopera— tive overall survival(x =17.849,P<0.001).Multivariate a— nalysis showed that p-FRK expression was an independent prog- nostic factor for overall survival of NSCLC patients(HR= dictor of prognosis for patients with NSCLC was further deter— mined.Results The positive expression rate of p-FRK in 0.496,95%CI:0.295-0.836,P<0.05).Conclusion As a novel NSCLC biomarker,the expression of p-FRK may predict a poor prognosis in the patients with NSCLC. Key words:lung neoplasm;non—small cell lung cancer;Src ki— NSCLC tissues(51.9%)was significantly higher than that of adjacent normal lung tissues(11.7%)(P=0.001).The ex- pression of p-FRK in NSCLC was significantly correlated with nase family;p-FRK;prognosis histopathologic type,lymph node status and pTNM stage(P<