小鼠肝细胞线粒体的Janus green B染色及观察
1. 实验目的：学习超活染色的原理及方法，用詹纳斯绿B给小鼠的肝细胞线粒体染色。 2. 实验用品：
（1） 仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、双凹载玻片
（2） 实验药品：蒸馏水、Ringer液、詹纳斯绿B染液 （3） 实验材料：小鼠 3. 实验原理：
（1） 活体染色又称超活染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色又无毒害的一种染色方法。这种染色方法常用的是化学染料。
目的：显示生活中细胞的某种结构，不影响细胞的生命活动或产生任何的物理、化学变化以致细胞的死亡。
应用：研究生活状态下细胞的形态结构和生理病理状态。
（2） 通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学” 特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并
非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。
（3） 选择活体染料的原则： ① 性质：有电化学特性 ② 低毒、无毒 ③ 低浓度：如实验中使用的是1/5000的詹纳斯绿B染液 ④ 专一、特异性：中性红可特异性地对植物液泡染色 ⑤ 常以碱性染料为主，因为碱性染料多可溶于类脂，容易穿膜。 4. 实验步骤：
（1） 用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。剪开腹腔，取出肝脏。选取边缘较薄的肝组织0.5cm2放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污。
（2） 滴加1/5000的詹纳斯绿B染液于双凹片的凹穴中，再将上述洗净肝组织移入染液染色20~30mins。以组织边缘被染成蓝绿色为准。
（3） 吸去染液，重新把组织置于小烧杯中。滴加Ringer液约0.5mL，用剪刀充分剪碎组织制成悬液。
（4） 静置上述悬液1~2mins，取静置好的悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察。 5. 实验结果：视野中可见比较大的、呈圆形的肝细胞，此种细胞内有一些小颗粒被染成蓝绿色，就是线粒体。视野中也有一些较小的细胞，有些可看到红色，是血细胞。 10*40显微镜下观察：
6. 分析与讨论
（1） 结果分析：部分肝细胞的线粒体被染成绿色
（2） 注意事项 ① 取肝组织：取肝组织时，应注意选择肝的边缘部分，这一部分组织的厚度差比分剪碎组织制成悬液。
（3） 静置上述悬液1~2mins，取静置好的悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察。 5. 实验结果：视野中可见比较大的、呈圆形的肝细胞，此种细胞内有一些小颗粒被染成蓝绿色，就是线粒体。视野中也有一些较小的细胞，有些可看到红色，是血细胞。 10*40显微镜下观察： 6. 分析与讨论
GENMED线粒体功能詹纳斯绿B染色试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
GENMED线粒体功能詹纳斯绿B染色试剂是一种旨在通过一种毒性较小的碱性染料特异性地使具有活性功能的线粒体呈现蓝绿色，从而判断线粒体功能的完整性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种线粒体（动物、人体、植物、昆虫等）制备物的功能检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简捷，性能稳定。 技术背景
线粒体是细胞中重要的细胞器，其主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌、肝、肾等器官和组织的细胞中。大量制备线粒体就是从这些器官组织中提取，或从组织培养细胞中提取。在光学显微镜下线粒体呈现为颗粒状、棒状或弯曲细线。
詹纳斯绿B（Janus green B），是一种毒性较小的碱性染料。它可以对活细胞进行直接染色，在细胞质内可以看到被染成蓝绿色的线状或颗粒小体的线粒体。线粒体所以能显示出蓝绿色，是由于线粒体中具有细胞色素氧化酶系统，它是染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中的染料被还原呈无色。 产品内容
GENMED保存液（Reagent A） 毫升 GENMED染色液（Reagent B） 毫升 GENMED清理液（Reagent C） 毫升 保存方式
保存在－20℃冰箱里；GENMED染色液(Reagent B)，避免光照；有效保证6月 用户自备
毫升离心管：用于线粒体染色的容器 光学显微镜：用于线粒体染色观察分析 实验步骤
实验开始前，将 ℃冰箱里的试剂盒中的GENMED染色液（Reagent B）置于冰槽里融化，并放在暗室里。然后进行下列操作。 一、纯化线粒体染色
1． 从纯化的线粒体样品中移出 至 微升（含 细胞中提取的线粒体）到新的预冷的 毫升
离心管，置于冰槽里（注意：线粒体须均匀分布，没有聚集成团）。 2． 加入等量微升的GENMED染色液（Reagent B），轻柔混匀 。 3． 放进暗室里，在室温下孵育1分钟。 4． 即刻移取 微升到载玻片上，放上盖玻片 。
5． 在光学显微镜油镜下进行观察：功能完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或椭圆形颗粒（注意：
可见蓝绿色渐渐变淡现象）。
6． 篮绿色强度显著减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧失。
二、活体细胞染色
1． 将待测细胞（ X 细胞）移入到1.5毫升离心管
2． 放进微型台式离心机离心1分钟，速度为500g（或2000RPM；例如 eppendorf 5415） 3． 小心抽去上清液
4． 加入 微升GENMED清理液（Reagent C）或GENMED保存液（Reagent A） 5． 加入 微升GENMED染色液（Reagent B），充分混匀 6． 放进暗室里，在冰槽里孵育 分钟 7． 即刻移取 微升到载玻片上，放上盖玻片
8． 在光学显微镜油镜下进行观察：功能完整的线粒体呈现蓝绿色线状或颗粒小体。 9． 篮绿色强度显著减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧
失 。
注意事项
1． 本产品为20次（活体细胞）或400次（纯化线粒体）操作 2． 所有操作均须无菌状态下进行
3． 线粒体样品操作须在低温下进行，且操作快速 4． 操作时，须戴手套
5． 建议染色完成后，即刻进行显微镜观察分析 6． 孵育时，须避免光照
7． 本公司提供系列线粒体试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能长期稳定 2． 本产品经鉴定显色清晰
使用承诺
杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。 友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。 订购信息 编号 名称 规格
GMS10015 GENMED线粒体功能詹纳斯绿B染色试剂盒 20/400次 GMS10015A GENMED保存液（Reagent A） 10毫升 GMS10015B GENMED染色液（Reagent B） 10毫升
GMS10015C GENMED清理液（Reagent C） 10毫升 产品编号 GMS10006.1 GMS10006.2 GMS10006.3 动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒 动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒 动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒 GMS10006.4.1 GMS10006.4.2 GMS10006.4.3 GMS10013.1 GMS10013.2 动物硬组织线粒体分离试剂盒 动物硬组织线粒体分离试剂盒 动物硬组织线粒体分离试剂盒 纯化线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒 活体细胞线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒 GMS10013.3 GMS10013.4 线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒 活体组织线粒体内膜功能/膜电位测定试剂盒 GMS10014.1 线粒体外膜功能检测试剂盒 20次 50次 10次 50次 50次 10次 100次 20次 10/50次 10/50次 10次 名称 规格 GMS10014.2 GMS10014.3 细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 细胞/组织悬液细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 20次 20次 GMS10014.4 GMS10015 GMS10016.1 GMS10016.2 GMS10016.3 纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒 线粒体功能詹纳斯绿B（JGB）染色试剂盒 细胞内活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒 细胞内活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒 活体组织活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒 20次 20/400次 20次 100次 8/20次 GMS10016.4 活体组织活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒 40/100次 GMS10016.5 冰冻切片活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒 50次 GMS10016.6 冰冻切片活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒 50次 GMS10067 细胞内活性氧（ROS）比色法定量检测试剂盒 100次 GMS10017.1 活体细胞线粒体损伤/氧化（NAO）荧光测定试剂盒 20/200次 GMS10017.2 纯化线粒体损伤/氧化（NAO）荧光测定试剂盒 20/200次 GMS10018 GMS10019 GMS10020.1 GMS10020.2 GMS20023.2 GMS20023.1 线粒体溶解试剂盒 线粒体形态染色试剂盒 活体线粒体跟踪试剂盒 活体线粒体长期跟踪试剂盒 全血线粒体DNA萃取试剂盒 纯化线粒体DNA萃取试剂盒 20次 100次 100次 20次 10/20次 20次
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容