卡伍尔氏链霉菌na4突变株Δbafai的次级代谢产物研究

摘要链霉菌产生的次级代谢产物是农用和医药抗生素的重要来源：为了更深入挖掘卡伍尔氏链霉菌

NA4潜在多样的次级代谢产物，对阻断NA4主产物bafilomycins的突变株SbafAI随机激活的代谢产物进行分

离和鉴定：采用HP20固相萃取、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及半制备HPLC等方法对AbafAI代谢产物进行分

离纯化；使用NMR和MS确定化合物结构，并对单体化合物进行了生物活性测定.共分离鉴定6个化合物：环

(厶-异亮氨酸-厶-脯氨酸)(1)、环(L-绳氨酸』-脯氨酸)(2)、环(厶脯氨酸』-亮氨酸)(3)、环(厶-脯氨酸-厶-苯丙氨 酸)(4)、(2E, 4£)-5-(3-^苯基)-戊-2, 4-二烯酰胺(5)和5'-脱氧-5'-甲硫肌甘(6) 6个化合物均是阻断NA4

主产物后非特异激活的或产量显著提高的化合物，均为该菌中首次分离；化合物5和6是第二次从天然提取

物中分离得到；化合物1和2显示出抗白色念珠菌活性，并首次报道了化合物5的抗氧化活性 进一步丰富

了卡伍尔氏链霉菌NA4次级代谢产物研究，为激活沉默或低表达次级代谢产物合成基因簇提供了有益借鉴

关键词 海洋微生物；卡伍尔氏链霉菌(Streptemyces cavourensis);次级代谢产物；基因敲除；生物活■性 中图分类号 Q939.9 文献标识码 A 文章编号 1005 -7021(2019)06 -0013 -07doi：10.3969/j. issn. 1005 - 7021.2019.06.002Secondary Metabolites of a Streptomyces cavourensis

NA4 Mutant Strain AbafAIZHANG Xiao-ying''2, PAN Hua-qi1, ZHANG Ying1 , SHI Yi-bing1 3, BAO Xiu-yan1'2, HU Jiang-chun1(1. Shenyang Inst, of Appl. Ecol. , Chinese Acad, of Sci. , Shenyang 110016；2. Chinese Acad, of Sci. , Beijing 100049 ； 3. Shenyang Pharm. Uni. , Shenyang 110016)Abstract Secondary metabolites of Streptomyces are important sources of agricultural and pharmaceutical antibiotics.In order to intensively explore the potential diversified secondary metabolites of Streptomyces cavourensis NA4 , random­

ly activated metabolites of mutant strain AbafAI which blocked bafilomycins, main product of NA4, were isolated and identified. HP20 solid phase extraction, silica gel column chromatography, and gel column chromatography and serni- prepared HPLC and other methods were used to isolate and purified the metabolites of AbafAI； the structures of the compounds were determined using NMR and MS, and the biological activity of the monomeric compounds was deter­

mined. A total of six compounds were isolated and identified: cyclo-( L-Ile-£-Pro) ( 1 ) , cyclo-( £-Val-L-Pro) (2 ),

cyclo-{ L-Pro-L-Leu) (3) , cyclo-( L-Pro-L-Phe) (4) , (2E, 4^)-5-(3-hydroxyphenyl) -penta-2 , 4-(!ienami(le (5 ), 5 r-deoxy-5 ^methylthioinosine (6). All of them were non-specifically activated compounds or significantly increase in yield after blocking the main products biosynthesis genes of NA4. All of the compounds were isolated firstly from

NA4. Compounds 5 and 6 were obtained and isolated from natural extracts for the second time ； compounds 1 and 2

showed inhibitory activities against Candida albicans, and antioxidant activity of compound 5 was firstly reported. This study further enriched the researches of the secondary metabolites of S. caverounsis NA4, and provided useful refer­

ences for activating silent or low-expression secondary metabolite synthesis gene clusters.基金项目：国家自然科学基金项目(41776178.41576136);辽宁省“兴辽英才计划” (XLYC1807268)作者简介：张晓瑛 女，硕士研究生 研究方向为海洋微生物次级代谢产物 E-mail ：zhangxiaoyingl6@ mails, ucas. ac. cn*通讯作者 男，研究员，博士，硕士生导师 研究方向为海洋微生物次级代谢产物 Tel ：024-88087741 , E-mail ： huje@ iae. ac. cn

收稿日期=2019-08-3014微生物学杂志39卷Keywords marine microorganism ； Streptomyces cavourensis ； secondary metabolites ； gene knockout ； biological activ-海洋链霉菌由于其独特的生理和代谢功能， 1材料与方法成为海洋微生物活性天然产物的重要来源⑴。研 究发现，海洋链霉菌能够产生丰富的次级代谢产

1.1材料物，包括生物碱、聚酮、氯代物和聚瞇类等，其中

1.1.1 菌株 卡伍尔氏链霉菌(Streptomyces

67%的海洋链霉菌代谢产物显示具有抗寄生虫、 cavourensis) NA4 , bafilomycins 合成阻断突变菌株 抗癌、抑菌、抗疟等生物活性3】。可见海洋链霉 AbafAI\\指示真菌：立枯丝核病菌(Rhizoclonia sola-

菌是发现抗生素和药物先导化合物的重要来源。

ni)、番茄灰霉病菌(BogZs cinerea)、黄瓜枯萎病

随着越来越多的链霉菌基因组被测序，发现它们 ( Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)、 白色 蕴含大量次级代谢产物合成基因簇，然而在常规

念珠菌(Candida albicans)；指示细菌:大肠埃希菌

实验室培养条件下，大多数的基因簇是沉默或者 (Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Stap/iy/ococcu5 低表达的。激活这些沉默或者低表达的基因簇， aureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、大黄欧 促使其产物增强表达成为深入挖掘次级代谢产物

文氏菌(Erwinia carotovora )和丁香假单胞菌

的主要策略阻断菌株主要代谢产物调控基因和

(Pseudomonas syringae )，以上菌株均由本实验室

合成基因，促使沉默基因簇或者低表达基因簇代 保藏。谢产物的表达，已成为挖掘代谢产物的重要方 1.1.2培养基 ①SFM培养基：黄豆饼粉20 g 式却。Becerril等⑸用阿泊拉霉素抗性基因，替

(水中煮沸40 min,无需过滤)，甘露醇20 g,自来

换 了 Streptomyces ar^illaceus 的 adpAa 基因，阻断

水1 L,琼脂条20 g；②R5培养基：蔗糖103 g,

adpAa基因表达，激活了杀菌素基因簇；余贞等⑷

K2SO4 0. 25 g,MgCl2 • 6 H2O 10. 12 g,葡萄糖 10

通过阻断变铅青链霉菌的负调控基因加dA,激活

g,酪氨酸0. 1 g,酵母提取物5 g,K2HPO40.5 g.l

了变铅青链霉菌中沉默放线紫红素生物合成基因 倍微量元素液1 mL,蒸憎水1 L,pH 7.2-7.4,(1 簇的表达;Song等⑺用阿普拉霉素抗性基因替换

倍微量元素液成分:FeSO4 - 7 H20 0. 1 g,MnCl2 -了天蓝色链霉菌中的Gcs(sco7221 ORF),产生

4 也()0. 1 g,ZnSO4 • 7 H20 0. 1 g,蒸憎水 1 L)；③

isogermicidins A-C三个新型天然产物。卡伍尔氏 TSB培养基:胰蛋白腺15 g,大豆蛋白腺5 g,NaCl链霉菌NA4由本课题组从中国南海深海沉积物 5 g,蒸憎水1 L,pH7.2-7.4；④PDA培养基：马 中分离，前期研究从NA4中分离得到两个主要抗

铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,自然pH；⑤沙 真菌活性的化合物bafilomycins Bl和Cl ,产量分

氏培养基：蛋白陈10 g,葡萄糖40 g,琼脂20 g,蒸 别为23. 45 mg/L和6. 60mg/L\"°进一步基因

憎水1 L。组挖掘发现，NA4不但能合成已鉴定的bafilomy- 1.1.3 仪器与试剂 超净操作台(BCN-1360B,

cins，而且具有合成 lantipeptide AmfS、alkylresor­北京东联哈尔仪器制造有限公司)；立氏压力蒸汽

cinol x frontalamide s desferrioxamine_B、non actin、ec・

灭菌锅(YSQ-LS-50S11,上海博讯实业有限公司医 toine、 isorenieratene、 rabelomycin、 lassopeptide

疗设备厂)；数控超声波清洗器(KQ3200DB,昆山 SR015-2005及其他未知结构类型化合物的潜

市超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(RE52-99上 能⑼。为了改变NA4菌株的代谢流，随机激活其 海亚荣生化仪器厂)；恒温摇床(DHZ-C,大仓市实

他类型的次级代谢产物，课题组前期通过PCR-

验仪器有限公司)；高效液相色谱仪(Ultimate-

targeting技术构建了阻断NA4主产物bafilomycins

3000,美国赛默飞世尔科技公司)；核磁共振仪

的突变菌株△见用川。)。本研究旨在研究突变菌

(AV-600 , Bruker) ； Sephadex LH20 (美国 GE 公

株创/随机激活或促使产量显著提高的次级 司)；静电场轨道阱高分辨质谱(Q Exactive MS,美 代谢产物，并对随机激活的代谢产物进行分离和 国赛默飞世尔科技公司)；色谱甲醇(国药化学试

鉴定。剂有限公司)；宛代试剂(美国剑桥CIL产品)。6期张晓瑛等:卡伍尔氏链霉菌NA4突变株SbafAI的次级代谢产物研究1512 方法1.2. 1菌株培养和发酵 在SFM培养基平板划 线突变菌株AbafAI（添加终浓度50 pg/mL的阿普 拉霉素和50 pg/mL的甲氧节氨唏噪）和野生菌

株NA4.置于28弋恒温培养箱，培养72 h,然后用 挖块法接种于装有50 mL R5培养基的锥形瓶，置

于28紀恒温摇床，180 r/min振荡培养72 h后用

作种子液,将种子液转接到含有1 L R5培养基的 锥形瓶，置于28七恒温摇床，180 r/min振荡培养

168 h,发酵总体积为30 L。1.2.2 发酵粗提物制备 将发酵液4 000 r/min 离心20 min,每升上清液加大孔吸附树脂HP20

60 mL,置于28七恒温摇床，180 r/min振荡2 h, 收集树脂，用无水甲醇洗脱3次，收集到的萃取物

减压浓缩干燥得到发酵粗提物30. 29 go1.2.3化合物分离纯化和结构鉴定将发酵粗 提物用硅胶快速柱色谱法初步纯化，用二氯甲烷

:甲醇（体积比,100 : 0 J00 : 2 J00 : 4 J00 :7 J00 : 10J00 : 15J00 : 30J00 : 50 和 0 :

100）梯度洗脱。100 : 2洗脱得到的憎分利用

Sephadex I.H20凝胶柱色谱分离，流动相为等体积 的二氯甲烷和甲醇，分成Fr. A和Fr. B；将Fr. A 利用半制备HPLC（30% MeOH）分离，得到化合物

① 26 mg,② 21. 6 mg,③ 4& 9 mg,④ 7. 9 mg。

100 : 4洗脱得到的憎分利用58%甲醇制备，得到 化合物a 1.3 mgo 100 : 7洗脱得到的憎分首先利 用ODS柱进行分离，得到45%甲醇洗脱憎分Fr.

C;然后将憎分Fr. C利用半制备HPLC（48%

MeOH）分离，再利用Sephadex LH20凝胶柱色谱 纯化，流动相为等体积二氯甲烷和甲醇，得到化合 物⑤2.4 mgo 100 : 10 MeOH洗脱得到的憎分利

用半制备HPLC（25% MeOH）分离,得到化合物⑥6. 1 mg。将分离得到的化合物通过NMR和Q Ex­

active MS进行结构鉴定。1.2.4 化合物抗菌活性测定 ①抗丝状真菌活 性测定：在PDA平板中央接种黄瓜枯萎病菌和

番茄灰霉病菌，待病原菌生长至菌落直径4 cm

时，在滤纸片加10 “L待测样（甲醇溶解，浓度1

mg/mL）,挥干甲醇后对称放置在病原真菌四周， 立枯丝核菌生长速度快，可以和滤纸片同时放置. 滤纸片的直径为8 mm. 10 “I.无水甲醇作为阴性 对照.10 jjlL 1 mg/mL的布雷菲德菌素为阳性对

照.置于28七恒温培养箱，培养24 h（立枯丝核病

菌），48 h（黄瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌），用游 标卡尺测量抑菌圈直径大小。②抗细菌和酵母 样真菌活性测定：取活化好的指示菌平板，用接

种环刮取一环菌体，制成菌体浓度为IO? ~ 108

cfu/mL的菌悬液（细菌培养基为TSB培养基，白

色念珠菌培养基为沙氏培养基），将菌液稀释100

倍，浓度变为105 - 106 cfu/mL0实验在96孔板上 进行，设10个浓度梯度，每个梯度设3个重复。

在96孔板的第一列中加入20 jit甲醇溶解的1

mg/mL的待测样品，在无菌操作台挥干甲醇，在

96孔板的第一孔加入200 piL培养基，混匀后从第 一孔中取100 \"L至第二孔，加等量培养基混匀， 再取100 至下一孔，依次操作，倍比稀释，最后 —孔混匀后弃去100 |jlL,在每孔中加入100 |xL稀

释的菌悬液，使每孔体积保持在200 ^L。此时第

1孔至第10孔的浓度依次为100、50、25、12. 5、

6. 25、3. 125 J. 562 5、0. 781 3、0. 390 6,0. 195 3

Mg/ml.,阴性对照分别为含菌培养基和不含菌培 养基，阳性对照为氯霉素（抗细菌活性）和布雷菲 德菌素（抗白色念珠菌活性）。将上述96孔板置

于37 T恒温培养箱，12 h后肉眼观察，待测样品

最低浓度孔无浑浊出现者，即为受试菌的最低抑 制浓度。1.2.5 ABTS自由基清除活性测定［⑴ 将配好

的ABTS - +溶液用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液稀

释,约稀释22倍，稀释后避光放置30 min,用紫外 分光光度计测定吸光度值，吸光度值（0.7 ±0.02） 为合格，可以使用。吸取稀释的供试品溶液各

100 4和ABTS…溶液100 L至96孔板中，混

匀，室温暗处反应6 min,734 nm处测定吸光度， 每个供试品重复测定3次，阳性对照为维生素C, 阴性对照为100 p,L的无水乙醇。ABTS' +清除率

计算公式如下：清除率％ = （ 1 - Asamp/Acont） x

100%，其中Asamp代表供试品溶液的吸光度值,

Acont代表阴性对照溶液的吸光度值，通过SPSS

软件进一步计算EC5。值（jimol/L） 02结果与分析21突变菌株AbafAI代谢粗提物HPLC-DAD 分析将突变菌株和野生菌株代谢产物进行HPLC-

16微生物学杂志39卷DAD分析，结果发现突变菌株」《於/的代谢产物 峰（化合物1 ~6和a）则显著增强（图1）。推测在

与野生株代谢产物相比.在保留时间9.0 ~ 17.0

阻断NA4主产物bafilomycins合成基因后,突变菌 min和30. 0 ~ 33. 0 min明显不同.在突变株 AbafAI 中，保留时间在 30.0 -33.0 min 的 bafilo­

株代谢流发生改变，使原低表达代谢物转变为高 mycins 消失，而保留时间9.0~ 17.0 min许多色谱

表达，产量显著增加。 •4.0(・ 5.()I ・ ・ ・ ・,7.5~~• _•_■■―I1().()_■■— ■~■_■12.5I_■■ —15.()■I~•~~ ■~~I17.5_•_ ■~20.()_I_ ”―■_22.5■_•I_■ ~I~~25.() 27.5_I~~■— •_•_30.0II 32.5—• — •~~I35.04.0 5'() 7.5 10.() 12.5 15.() 17.5 20.6 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.()图1突变菌株AbafAI和野生菌株NA4发酵液代谢产物图谱(UV： 200 ~400 nm)Fig. 1 Mrlalx)lites analysis of mutant AbafAI and wild NA4 ( UV : 200400 nm)2.2 化合物结构鉴定共分离得到6个随机激活的单体化合物（图2）, 从NA4突变菌株的次级代谢产物中结构鉴定如下：图2突变菌株AbafAI中分离的化合物结构Fig. 2 The compounds isolated from the fermentation brotli of mutant AbafAI2. 1. 1化合物1无色晶体（甲醇）；HPLC-DAD 检测最大吸收波长为210 nm,HR-ESI-MS给出6期张晓瑛等:卡伍尔氏链霉菌NA4突变株AbafAI的次级代谢产物研究17m/z：211. 144 5 [M +H] + ,确定其相对分子质量 为210. 136 7,推导其分子式为C„H18N202o进一

步根据'H-NMR和“C-NMR数据鉴定化合物1为 环(■异亮氨酸-厶脯氨酸)['243]。具体信号如 下：'H-NMR(DMSO-£/6,600 MHz)8h：7.96( lH,s,

H-8) ,4. 10(lH,t,/ = 7.0 Hz,H-6) ,3. 94( lH,s, H-9) ,3. 37 (2H, m, H-3) ,2. 12 ( 1H, m, H-5a),2. 01 (lH,m,H-10) ,1. 81 (3H,m,H-4,5b) ,1.30 (2H,m,H-ll) ,0. 97(3H,d, J =7. 1 Hz,H-13),

0. 81(3H,t, J =7. 4 Hz,H-12) ；I3C-NMR( DMSO-

虫，150 MHz)8C: 170. 1 (C-7), 165. 3( C-l) ,59. 2

(C-6) ,58. 2(C-9) ,44.7(C-3) ,34.9(C-10) ,27.9 (C-5),23. 9 ( C-l 1 ),22. 1 (C-4), 15. 0(C-13), 12. 3(C-12)O2.2.2 化合物2 无色晶体(甲醇):HPLC-DAD 检测最大吸收波长为210 nm,HR-ESI-MS给出

zn/z ：197. 129 1 [M + H] + ,确定其相对分子质量

为196. 121 3,推导其分子式为CI0H,6N202o进一

步根据'H-NMR和口C-NMR数据鉴定化合物2为 环(厶缄氨酸脯氨酸)[12431。具体信号如

下：'H-NMR(DMSO-虫 ,600 MHz)8h：7. 96( lH,s, H-8) ,4. 11 (=7. 3 Hz,H-6) ,3. 90( lH,s,

H-9) ,3.37(2H,m,H-3) ,2.33(lH,m,H-5) ,1. 81 (2H,m,H4) ,1.78( lH,m,H-10) ,1.00(3H,d,J

=7. 2 Hz, H-ll ),0. 83(3H,d, J = 6. 8 Hz, H-

12) ；13C-NMR( DMSO-d6,150 MHz) 5C ： 170. 3 ( C-

7),165.2(C-1) ,59.5(C-6) ,58. 3(C-9) ,44.6(C- 3) ,27.9(C-5) ,27.7(C-10) ,22. 1(C4),18.4(C-

11),16.4(012)。2.2.3化合物3 无色晶体(甲醇)；HPLC-DAD 检测最大吸收波长210 nm,HR-ESI-MS给出m/z：

211. 144 5 [M+H]J确定其相对分子质量为

210.136 7,推导其分子式为C„HI8N202o进一步

根据'H-NMR和\"C-NMR数据鉴定化合物3为环 (厶脯氨酸-1-亮氨酸)tl2J1o具体信号如下：'H-

NMR(DMSO-d6,600 MHz)%：8. 00( 1H,s,H-8), 4.18(lH,t J=&0 Hz,H-6) ,3. 99( lH,t J =6. 2

Hz,H-9),3.35(2H,m,H-3),2.10(lH,m,H-

5a),1.83(5H,m,H4,5b,10),1.33(lH,m,H- 11) ,0.85(6H,t,J =6. 0 Hz,H-12,13) ；i3C-NMR

(DMSO-1),58. 5(C-6) ,52.6(C-9) ,44.9(C-3) ,37. 8(C-

10) ,27.4(C-5) ,24. 1 ( C-l 1) ,22. 8 ( C-12) ,22. 5

(C4),21.9(C-13)O2.2.4 化合物4 无色油状(甲醇)；HPLC-DAD检测最大吸收波长210 nm,HR-ESI-MS给岀m/z-

245. 129 0 [M+H] + ,确定其相对分子质量为

244. 121 2,推导其分子式为C14H16N2O2o进一步

根据，H-NMR和\"C-NMR数据鉴定化合物4为环

(L-脯氨酸-厶苯丙氨酸)[l3]o具体信号如下：也-

NMR(DMSO<,600 MHz)%:8. 00(1 H,s,H-8), 7.23(5H,m,H-2'0) ,4. 33(

=4. 92 Hz,H-9) ,4.06( = 8. 88 Hz,H-6) ,3. 38( 1H,m,H-3) ,3. 26( lH,m, H-3) ,3. 06( lH,dd,./ =

14. 2,5. 3 Hz,H-10) ,3. 01 (lH,dd, J = 14. 2,2. 8

Hz,H-10) ,2. 00( 1H, m, H-5 ) , 1. 71 (2H, m, H-

4),1.40( lH,m, H-5)；u C-NMR ( DMSO-(76, 150 MHz)8c ：169. 1( C-7) ,165. 1 (C-l) ,137. 3( C-lz),

129.8(02',6') ,128.0( C-3',5') , 126. 3 ( C4),

58.4(C-6) ,55.7(C-9) ,44.6(C-3) ,35.3(C-10),

27.8(05) ,21.9(C4)。2.2.5

化合物5 无色针状物(甲醇)；HPLC-

DAD 检测最大吸收波长307 nm,HR-ESI-MS给出

m/z：221.081 4 [M + Na]+ 和 190. 086 7 [M + H]+ , 确定其分子量为189.078 9,推导其分子式为C„

H„N02o进一步根据'H-NMR和13C-NMR数据鉴 定化合物5为(2E, 4E)-5-(3-^苯基)-戊-2, 4-二 烯酰胺具体信号如下：'H-NMR(400 MHz,

DMSO-6. 97(2H, m, H-10, 11 ), 6. 91 ( 2H, m, H-7,9 ), 6. 83( 1H, d, J = 15. 5 Hz, H-5) ,6. 70( 1H, m,- NH2) ,6. 10( lH,d, J = 15. 0 Hz, H-2) ； l3C-NMR

(150 MHz, DMSO-8) ,139.6(C-3) ,138.2(C-5) , 137. 6( C-6), 129. 7 (C-10) ,126. 8( C4) ,125. 5( C-2) ,117. 9( C-l 1),

115.7(09) ,113.5(07)。2.2.6 化合物6 白色粉末(甲醇):HPLC-DAD

检测发现最大吸收波长248 nm,HR-ESI-MS给出

/n/z ：299. 061 6 [M + H] + ,确定其相对分子质量 为298. 053 8,推导其分子式为ChH,4N404So进 一步根据'H-NMR和口C-NMR数据鉴定化合物6

为5'-脱氧5-甲硫肌昔2。具体信号如下JH-

NMR(DMSO-d6,600 MHz)%：& 32(1H,s,H-8),

18微生物学杂志39卷8.07(lH,s,H-2) ,5.86( lH,dJ = 5.8 Hz,H-1'), 4.62 ( 1H, m, H-2') , 4. 09 ( 1H, m, H-3') , 4. 02

(lH,m,H4),2. 85(lH,dd,_/= 13. 9 Hz, J = 5. 9 Hz,H-5za) ,2. 75 (1H ,dd, J = 13.9 HzJ=6.9

Hz,H$b) ,2. 05 ( 3H, s,-SCH,) ；13 C-NMR ( DM-

S0-rf6,150 MHz) 5C： 156. 6 ( C-4 ) , 148. 4( C-6),

146. 0( C-2 ) ,139. 0(C-8) ,124.5( C-5 ) ,87. 3(C- I') ,83. 9(C4) ,73. 1 (C-2‘)，72. 5(03') ,36. 0

(C-5Z) ,15.6(-SCH3)O2.3

化合物抗菌活性测定抗菌活性结果显示化合物1和2对白色念珠 菌有抑制作用，最小抑制浓度均为50 fxg/mL,比 对照布雷菲得菌素的活性低(3. 125 p.g/mD.6

个单体化合物在最大浓度100 pig/mL时对细菌

(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、 大黄欧文氏菌和丁香假单胞菌)未检测到活性; 在1 mg/mL浓度时病原真菌(立枯丝核病菌、番 茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌和白色念珠菌)也未

检测到活性。2.4 化合物对ABTS自由基的清除活性采用ABTS方法测试化合物对自由基的清除

活性,化合物5浓度5 jxmol/L时清除率为(8. 63

± 0.85)% ,浓度 10 p.mol/L 时清除率为(14. 85 ± 0.41 )% ,浓度 50 jjimol/L 时清除率为(5& 89 ± 3. 15)% ,浓度 100 ixmol/L 时清除率为(7& 05

± 3.39)%,浓度 200 p.mol/L 时清除率为(80.59

±4.90)%。通过SPSS软件计算，化合物5的 EC：。值为(39.73 ±2.97) pmol/L,阳性对照维生 素 C 的 EC50值为(6. 12 ±0. 17) p.mol/Lo 实验结 果表明化合物5具有一定的自由基清除活性，但

比维生素C的自由基清除活性低。3讨论本研究对阻断NA4主产物bafilomycins的突

变株AbafAI随机激活的代谢产物进行分离和鉴

定。总共得到6个化合物,均是首次从该菌中分 离得到的；化合物1 ~6均是阻断NA4主产物之

后产量提高的化合物;生物活性测定结果发现化

合物1和2显示较弱的抗白色念珠菌活性，并首 次发现了化合物5的抗氧化活性；图1中的化合

物a虽然对大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌和立枯丝

核菌都显示出较好的抑制作用,但是由于量较少，

所以未能进行结构解析。文献调研发现环(L-异 亮氨酸丄-脯氨酸)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

(methicillin-resistant Staphylococcus qumus)有抑制 作用(0;环(厶亮氨酸-厶脯氨酸)显示细胞毒活 性，能够抑制K562细胞、HI』0细胞、BGC-823细 胞和HeLa细胞“；环(厶-颌氨酸脯氨酸)对尖

抱镰刀菌(Fusarium oxysporum)、青霉菌(Penicilli-

um sp.)和前列腺癌细胞LNCaP有抑制作 用\"\":；环(•亮氨酸脯氨酸)和环(厶苯丙氨 酸-厶-脯氨酸)组合使用对抗万古霉素肠球菌

(vancomycin-resistant Enterococci)有较强的抑制作 用：20-；(2£, 4E)-5-(3-羟苯基)-戊-2,4--烯酰胺

对结核分枝杆菌有较强的抑制作用〔⑷。综上文 献调研发现环二肽类化合物具有多种抗菌和抗肿 瘤活性，可见环二肽类化合物在药物及其相关研 究领域中有着巨大的发掘潜力。挖掘菌种次生代谢产物方法有多种，包括传 统OSMAC策略\"，插入强启动子激活正调控基 因也〕，阻断负调控基因〔23〕，核糖体工程us ,加入 小分子物质3〕，共培养等方式激活沉默基因

簇。本研究尝试了阻断NA4主产物来非特异激 活其他次级代谢产物的产生。当阻断NA4主产 物合成基因后，突变菌株代谢流发生改变，增加了

其他代谢物的积累；同时，去除原主产物后简化了

NA4菌株代谢产物分离过程中背景信息干扰，有 利于微量化合物分离，提高新的化合物和微量化

合物分离的几率，这一策略为微生物代谢产物的 分离纯化提供了有益借鉴。本研究也进一步丰富

了 Streptomyces caverouiisis代谢产物成分研究以及 生物活性研究，为深入挖掘该菌潜在活性次级代

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