昆虫杆状病毒表达系统在动物疫苗研究的应用

昆虫杆状病毒表达系统在动物疫苗研究的应用

杨旭东，朱庆贺，王　刚，王　爽，陈　曦，王观悦

（黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔１６１００５）

摘　要：昆虫杆状病毒表达系统（Ｉｎｓｒｃｔｃｅｌｌｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ，ＩＣ－ＢＥＶＳ）是基因工程四大表达系统之ＮＡ插入，细胞培养易于大规模获一，它具有重组蛋白表达量高，能够在一个载体上表达多种蛋白，容纳较大片段的外源Ｄ得蛋白等特点。在很多领域都有广泛的应用，文章旨在介绍其在动物疾病方面的研究进展。关键词：昆虫；杆状病毒；表达系统；动物疾病

中图分类号：Ｓ８５２．４　　　　　文献标识码：Ｂ　　　　　ＤＯＩ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０１８．０６．００５

使表达蛋白形成三级或四级复杂结构，进而使外源蛋白尽可能有天然蛋白的结构，具有很高的蛋白活性，免疫原性可媲美天

４］

。杆状病毒表大系统启动子能够高效的驱动靶基因然蛋白［

󰀡　引言

杆状病毒表达系统自建立以来广泛应用于生物检测、疫苗生产、基因治疗等方面。昆虫细胞－重组杆状病毒系统提供了一种蛋白质生产系统，生产可溶形式的重组蛋白，并能高效表达。表达的蛋白质具有大多数的翻译后修饰的功能，因此产生的膜蛋白具有正确的折叠构象，这是该方法优于原核表达系统的主要特点

［１］

高效表达，目的蛋白表达量可达到细胞总蛋白的５０％左右。杆状病毒全基因组较大分子量（９０～１８０ｋｂ），具有多个天然强启动子，可以插入ＤＮＡ（约１０ｋｂ）较大片断的外源基因；并能够多基因同时表达，实现同时容纳多个外源基因。多个基因共表达，可以克服成分单一的亚单位疫苗免疫原性弱的缺点，病毒样颗粒还可以发挥佐剂的作用。

杆状病毒不能感染哺乳动物，对人类没有致病性，应用没有安全顾虑；使用的昆虫细胞Ｓｆ２１，Ｓｆ９或Ｈｉｇｈｆｉｖｅ可在无二氧化碳条件下２７℃进行贴壁或悬浮培养，操作相对简单，工业化生产方面具有天然优势。

。昆虫杆状病毒表达系统主要是针对杆状病毒

构建载体，与哺乳动物细胞表达系统相比大大缩短了从基因克隆到蛋白表达的时间。杆状病毒基因组较大，能够克隆大的ＤＮＡ片段，从而能够表达复杂的蛋白质聚集体。杆状病毒不能感染非昆虫来源的细胞，因此表达系统表达的重组蛋白对人和动物无害。

󰀢　杆状病毒表达系统生物学

杆状病毒（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）因病毒呈杆状而得名，是一种有囊ＮＡ病毒。杆状病毒主要包括核多角膜包裹的闭合环状双链Ｄ

体病毒属和颗粒体病毒属，其中核多角体应用较广泛

［２］

󰀥　杆状病毒表达系统在动物疾病研究中的应用

２００６年勃林格殷格翰公司首次推出猪圆环２型病毒载体灭活疫苗，于２０１０年获农业部批准引入，成为国内第一个针对Ｌ２周龄起保猪圆环病毒感染的疫苗。疫苗保护力好１针１ｍ

护至出栏。在禽流感疫苗研究方面，Ｒｅｚａｅｉ等将重组有禽流感病毒Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２ＨＡｓ和Ｍ１基因的杆状病毒共同转染昆虫细胞，免疫小鼠后攻毒，与对照相比，免疫小鼠并未出现死亡等其

５］

他反应［。昆虫杆状病毒表达系统针对细菌感染的亚单位疫

。目前

报道杆状病毒能够感染６００多种昆虫细胞，无脊椎动物的细胞是其宿主细胞。在Ｇｅｎｂａｎｋ上，可以检索到多条完整的杆状病毒基因组序列，虽然不同种类杆状病毒基因组差别很大，但有近３０个参与ＤＮＡ复制、表达、病毒入侵及装配等基因编码有关的核心基因，在所有杆状病毒的基因组中高度保守。此外，调节宿主基因表达的蛋白编码区的基因序列也相对保守。杆状病毒在基因表达的极晚期，为了抵御虫体之间横向传播时外界环境的不利因素，分别受到超强ｐｏｌｈ启动子大量合成多角体ｐｏｌｈ），多角体蛋白形成包裹体基质。ｐ１０启动子调控大蛋白（

量合成Ｐ１０蛋白，ｐ１０蛋白参与包裹体从细胞核中的释放。杆状病毒表达系统的基础是外源基因插入杆状病毒超强ｐｏｌｈ启动子和ｐ１０启动子之后，通过这两种启动子来大量表达外源蛋白。缺失这两种蛋白，杆状病毒在培养的细胞间和昆虫体内进

３］

行传播不受影响［。

苗的报道较少，仅见到有使用杆状病毒载体系统表达布鲁氏杆菌热激蛋白的报道。寄生虫疫苗研究方面，杆状病毒昆虫表达系统细粒棘球蚴Ｅｇ９５抗原，具有良好的免疫原性，为优化细粒

６］

棘球蚴疫苗提供了热点候选分子之一［。目前，杆状病毒载体

系统主要应用于动物病毒疫苗的研究，包括口蹄疫病毒、羊痘病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒等相关蛋白均在杆状病毒系统内表达，且被证实可以引起机体产生较高水平免疫应答，但大多数疫苗仅限于实验室研究。

󰀦　结语

昆虫杆状病毒表达系统，不仅应用于亚单位疫苗的研发和生产，还应用于重组蛋白结构功能研究，作为免疫原制作单克隆抗体，进入某些哺乳动物细胞基因治疗、生物防治等领域。

（下转第１３页）

󰀤　杆状病毒表达系统的特点

杆状病毒表达系统对翻译后进行加工修饰蛋白机制完善，

收稿日期：２０１８－０５－１８

１０

２０１８年第６期（总第３４９期）畜禽业试验研究

灭活疫苗肌注免疫后，免疫抗体ＯＤ均值快速上升，１５０日龄批次样品检测结果达到０．１３６，１８０日龄批次继续上升至０．１８５，１０日龄时已快速下降至０．１２２，２４０日但抗体上升期较短，在２龄时的ＯＤ均值已消退到０．０９５，接近ＯＤ临界值，说明ＩＢＤ灭活苗肌注免疫有较好的免疫作用，但抗体有效维持期仅约４个３个批次样品的ＯＤ均值又出现了一轮强劲反弹，但月。其后，

期间末进行任何相关的免疫措施，提示试验鸡群在此阶段可能感染了ＩＢＤ病毒。

２．２．３　试验山鸡ＩＢＤ抗体阳性合格情况

分析表４和图２，可见试验鸡群ＩＢＤ免疫抗体阳性合格率有２个明显的变化区间，一个是在１２０日龄以前的低水平区５０日龄后的高水平区间，而１２５日龄的免疫间，另一个是在１是二个区间的拐点。

在低水平区间７个批次样品中，阳性合格率最高的仅为２５％，最低为０。虽然二次饮水免疫也未见效，抗体检测ＯＤ均值无明显提高；在高水平区间，又可分为２个高峰阶段，第一个高峰段是１２５日龄免疫后，抗体快速上升并维持３个月后的消退阶段，此阶段抗体阳性合格率最高值达到了８０％；第二个高峰段是本次试验的最后３个批次样品，在灭活疫苗抗体逐步消退至临界值后，可能是受到ＩＢＤ野毒感染，试验鸡群的抗体阳性合格率出现了一波强势反弹，高峰值达到了９０％，这一变动现象与ＩＢＤ抗体ＯＤ均值的变动情况相符。

平，且可有效维持３个月以上，说明２次中等毒力活疫苗的饮水免疫，虽然未能有效提高早期免疫抗体水平，但仍起到了较好的基础免疫作用，为灭活疫苗的免疫起到一定的协同作用。

２）相关资料显示，免疫接种ＩＢＤ疫苗是预防本病的一种（

有效措施。目前在我国批准使用的疫苗主要有弱毒苗、灭活苗和进口的中等毒力活疫苗（Ｄ７８）。临床上低毒力株弱毒疫苗主要用于无母源抗体或低母源抗体的鸡群，一般在出壳后用滴鼻、点眼＋肌注的方式超前免疫１次，２～３周时用中毒活疫苗中毒活疫苗主要是供有母源抗体的鸡群使用；灭活加强１次；

疫苗主要是供种鸡群使用。

（３）结合本次试验结果，建议山鸡ＩＢＤ的免疫程序见表５。

表５　种山鸡ＩＢＤ免疫程序

序号１２３４

日龄０１４１２５２４０

疫苗名称ＩＢＤ（中毒）活疫苗ＩＢＤ（中毒）活疫苗ＩＢＤ灭活疫苗ＩＢＤ灭活疫苗

免疫方式滴鼻、点眼饮水肌肉注射肌肉注射

免疫剂量各１滴１头份０．５ｍＬ０．５ｍＬ

参考文献

［１］　Ｙ．Ｍ．Ｓａｉｆ．禽病学（第十一版）［Ｍ］．北京：中国农业出版

社，２０１２．

［２］　邓干臻．兽医临床诊断学（第三版）［Ｍ］．北京：科学出版

社，２００９．

［３］　谷子林，和英布．特禽标准化生产技术［Ｍ］．北京：中国农

业大学出版社，２００３．

［４］　沈强，丁鼎立．特种经济动物养殖手册［Ｍ］．上海：上海科

学技术出版社，２０１５．

󰀥　讨论

（１）试验结果显示，亲本母山鸡拥有较高的ＩＢＤ母源抗体，但试验山鸡未能通过种蛋垂直获得这些较高的ＩＢＤ母源抗体，而且在２次使用Ｄ７８中毒活疫苗进行饮水免疫后，未能有效提升试验山鸡早期免疫抗体；但青年种山鸡在上笼后使用灭活苗进行肌注免疫后，可使ＩＢＤ免疫抗体快速提升至较高水

（上接第１０页）［４］　张民秀，谢芝勋，黄莉，等．Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒ＨＡ基

参考文献

［１］　郑瑾，任斐，余翔，等．利用昆虫－杆状病毒表达系统制备

ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白［Ｊ］．西北大学学报，２００８，３８（５）：７７５－７７８．

［２］　李晶梅，靖志强．昆虫杆状病毒表达系统生产流感疫苗的

研究进展［Ｊ］．中国兽药杂志，２０１２，４６（１２）：６７－７０．［３］　陈琳，吴小锋．昆虫杆状病毒粒子的蛋白质组成及生物学

功能［Ｊ］．蚕业科学，２０１４，４０（３）：５３３－５４３．

因在昆虫细胞中的表达［Ｊ］．基因组学与应用生物学，２０１７，３６（３）：８５９－８６４．

［５］　ＢａｅＪＥ＆ＴｏｔｈＴＥ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｋｉｎｅｔ－ｉｃｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ

Ｂｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ［Ｊ］．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，７５：１９９－２０４．［６］　周必英，陈雅棠，李文桂．细粒棘球绦虫Ｅ９９５基因工程

疫苗研究进展［Ｊ］．中国地方病学杂志，２００８，２７（６）：７０９－７１１．

１３