桃仁膝康丸HPLC指纹图谱研究

桃仁膝康丸HPLC指纹图谱研究

目的 建立桃仁膝康丸高效液相色谱指纹图谱，提供较全面评价、控制制剂质量的方法。方法 采用高效液相色谱-紫外检测法分析10批桃仁膝康丸的甲醇提取物。色谱柱Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-水梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm。结果 建立了桃仁膝康丸高效液相色谱指纹图谱，共标示26个共有指纹峰，10批被测样品的色谱指纹图谱整体相似度在0.9以上。结论 本方法准确可靠，可有效控制桃仁膝康丸的制剂质量。

标签：桃仁膝康丸；高效液相色谱法；指纹图谱

桃仁膝康丸是河南省正骨研究院的医院制剂[批准文号：豫药制字Z20120243（洛）]，由桃仁、红花、三七等10余味中药组成，是平乐郭氏正骨的传统药物，临床应用已20余年，主要用于治疗骨关节病早期关节疼痛、屈伸不利、膝部疼痛等症。中药指纹图谱能全面反映中药内在化学成分的种类与数量，利用指纹图谱相似度评价结果可直观分析不同批次制剂的质量差异，指导制剂生产过程中原药材的选择及生产工艺的优化。为更全面地评价、控制桃仁膝康丸的质量，本试验采用高效液相色谱法（HPLC）建立桃仁膝康丸甲醇提取物的指纹图谱，并进行白芍、三七指标性成分的色谱峰归属，对桃仁膝康丸质量进行整体描述和评价，为该制剂的进一步研发提供数据积累。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，DAD检测器，Agilent化学工作站，色谱柱Agilent C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 ?m），XS205DU电子天平（梅特勒-托利多有限公司），TP300型超声波提取器（天鹏电子新技术北京有限公司），HC-100型化晨高速多功能粉碎机（浙江省永康市金穗机械制造厂）。

芍药苷对照品（批号110736-201035，中国食品药品检定研究院），人参皂苷Rg1对照品（批号110703-201027，中国食品药品检定研究院），桃仁膝康丸（批号20100805、20101205、20110108、20110205、20110408、20110605、20110805、20111005、20111208、20120105、20120305）购自河南省正骨研究院，试剂乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相A为水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0 min→10 min→22 min→35 min→55 min→70 min→85 min→100 min，流动相A为95%→90%→82%→73%→52%→44%→35%→35%；流速1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量20 ?L；采样时间100 min。

2.2 对照品溶液的制备

分别取芍药苷、人参皂苷Rg1对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为40.50、108.35 ?g/mL溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品约3 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液浓缩并定容至10 mL，用0.45 ?m微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液20 ?L，按“2.1”项下色谱条件进样，连续进样5次，记录色谱图中共有峰保留时间和峰面积，结果显示，共有峰的相对保留时间和相对峰面积积分值均RSD<3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 分别精密称取同一批样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各共有峰保留时间和峰面积。结果共有峰的相对保留时间和相对峰面积积分值均RSD<3%，重复性良好，符合指纹图谱要求。

2.4.3 稳定性试验 取同一批供试品溶液，在相同的条件下分别于0、4、6、8、12、24 h测定，共有峰的相对保留时间和相对峰面积积分值均RSD<3%，符合指纹图谱要求，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 共有指纹峰的标定 根据10批供试品溶液的测定结果，分析确定了桃仁膝康丸的26个共有指纹峰，见图1；不同批次样品的色谱叠加图见图2。

2.5.2 共有指纹峰的相对保留时间及峰面积比值 分别精密称取桃仁膝康丸10批样品各3 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各共有峰保留时间和峰面积。样品以13号峰峰面积值作为参照，计算各共有峰相对相对保留时间及峰面积积分值。结果见表1、表2。

2.5.3 指纹图谱相似度测定 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A）计算软件，采用相关系数法对10批桃仁膝康丸进行了相似度计算，结果见表3。结果显示，10批样品相似度良好。

2.6 归属定性分析

取芍药苷、人参皂苷Rg1对照品，按“2.1”项下色谱条件进样分析，根据保留时间定位分析，判断4号峰为芍药苷、8号峰为人参皂苷Rg1。对照品色谱图见图3。

3 讨论

本试验在考察提取方法时，参考白芍、三七等药材指标性成分含量测定的提取方法[1-2]，比较了用甲醇超声提取和回流提取的差别，发现回流提取小峰较多，且基线不稳，而采用超声提取法提取效率较佳，色谱峰分离度、基线情况明显改善，因此，样品采用甲醇超声提取。

本试验采用203、230、322 nm波长进行测定、分析，通过对在各波长下的出峰情况、基线的平稳程度，以及各成分的分离情况等综合考虑，最终选定检测波长为203 nm。试验分别考察了甲醇-水、乙腈-水流动相体系，发现甲醇-水流动相体系，柱压较高，且基线漂移现象较严重。采用乙腈-水流动相体系，基线平稳，白芍、三七等指标性成分可达到较好分离。采用梯度洗脱方法，色谱峰分离效果较好，满足指纹图谱的要求。

本试验建立了桃仁膝康丸甲醇提取物的指纹图谱，对桃仁膝康丸质量进行整体描述和评价，归属指标性成分芍药苷、人参皂苷Rg1色谱峰，方法简便可行，重复性好，可用于桃仁膝康丸的质量控制，以保证制剂质量稳定和临床疗效，并为该制剂进一步研发与应用提供数据积累。

参考文献：

[1] 杨柳，许舜军，田润涛，等.白芍的高效液相色谱指纹图谱研究[J].药学学报，2007，42（1）：71-74.

[2] 李俊松，陈军.快速分离液相色谱法测定三七中3种皂苷的含量[J].医药导报，2009，28（12）：1625-1626.