胃癌组织中SCD1的表达及其对胃癌细胞增殖侵袭能力的影响

响

陈文彬;吴德谋;邹永平

【摘 要】Objective:To observed the expression of SCD1 and explore its correlation with cell proliferation and metastasis in gastric

cancer.Methods:The gastric cancer and para-cancerous tissues from 32 cases was collected.The expression of SCD1 was detected by qPCR.The HCG-27 cell lines with stable over-expression of SCD1 were

established.The proliferation and invasion abilities of cells were detected by MTT and Transwell assay,respectively.The expression of molecule related epithelial-mesenchymal transition (EMT)related proteins such as E-cadherin,β-catenin and N-cadherin were determined by western

blotting.Results:SCD 1 mRNA expression was significantly higher in gastric cancer tissues than that in para-cancerous tissues (P＜ 0.05).The

proliferation and invasion abilities of SCD1-interfered HCG-27 cells were notably decreased (P＜ 0.05).The expression of E-cadherin was up-regulated,while β-catenin and N-cadherin expressions were down-regulated (P＜0.05).Conclusion:Over-expression of SCD1 could promote the proliferation and metastasis of gastric cancer cells and the EMT process.%目的:探讨硬脂酰辅酶A去饱和酶1 (SCDl)在胃癌组织中的表达及其与细胞增殖侵袭能力的关系.方法:收集临床32例胃癌患者的胃癌组织及相应癌旁组织,采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测组织中SCD1的表达;在体外实验中,采用慢病毒转染的方法建立稳定干扰SCD1表达的HCG-27胃癌细胞系,采用MTT

法检测细胞增殖能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,采用western blotting检测上皮间充质转化(EMT)相关蛋白分子(E-cadherin、β-catenin及N-cadhefin)的表达.结果:SCDl mRNA相对表达量在胃癌组织高于相应的癌旁组织(P＜0.05).HCG-27细胞稳定干扰SCD1表达后,细胞增殖能力显著下降(P＜0.05),细胞侵袭能力也明显降低(P＜0.05);E-cadherin表达上调,而β-catenin及N-cadherin表达下调(均P＜0.05).结论:SCDl在胃癌组织中呈高表达,能促进胃癌细胞的增殖侵袭及EMT过程,在胃癌的发生和发展中发挥促癌作用. 【期刊名称】《广西医科大学学报》 【年(卷),期】2017(034)009 【总页数】4页(P1285-1288)

【关键词】SCD1;胃癌;细胞增殖;细胞侵袭;EMT 【作 者】陈文彬;吴德谋;邹永平

【作者单位】海口市人民医院滨江分院,海口 570208;海口市人民医院消化内科,海口 570208;海南省人民医院急诊科,海口 570311 【正文语种】中 文 【中图分类】R735.2

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织国际癌症研究中心公布的数据，2010年全世界范围因胃癌死亡的病例为73.7万，其中我国达35.2万，占全球胃癌死亡的47.8%[1]。尽管随着全人群健康教育的普及和生活质量的提高，胃癌死亡率近年呈现出下降趋势，但仍居我国恶性肿瘤第三位[2]，严重威胁着人们的生

命健康。近年来许多研究显示，硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）参与乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的发生发展[3-4]。基于此，本研究对SCD1与胃癌增殖和侵袭的关系进行深入探讨，为进一步的研究及确定更有效的临床诊治方案提供线索和依据。 1 资料与方法 1.1 一般资料

临床样本取自2015年5月至2016年10月海口市人民医院滨江分院普通外科收治的32例胃癌患者，手术切除癌组织及癌旁组织（距离癌变边缘5 cm以上切取），并置于液氮保存。患者基本资料：男18例，女14例；年龄32～67岁，平均（51.7±12.4）岁；体重39.6～75.1 kg，平均（58.6±13.4）kg；TNM分期情况：Ⅰ期4例，ⅡA期8例，ⅡB期7例，Ⅲ期13例。所有患者均为原发胃癌并未经过任何形式的相关治疗，且未合并其他严重器质性疾病。 1.2 细胞及培养

本实验所用胃癌细胞系HGC-27及293T来自美国模式菌种收集中心（The Global Bioresource Center，ATCC），使用含10%胎牛血清的DMEM或1640培养基，37℃，5%CO2恒温生化培养箱中培养。 1.3 实验材料

1.3.1 实验仪器 美国伯乐公司Bio-Rad超净工作台、电泳仪、转膜仪、凝胶成像仪及酶标仪、美国赛默飞公司NanoDrop2000超微量分光光度计、德国艾本德Eppendorf PCR仪、美国应用生物系统公司ABI 7500 Real-time PCR仪等。 1.3.2 实验试剂及抗体 RPMI-1640培养基、DMEM培养基、Fetal Bovine Serum（Hyclone）、trizol（Takara公司，Code No.9108）、逆转录试剂盒（Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit,Fermentas）、实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（iQ SYBR Green Supermix，Bio-Rad）、细胞增殖能力

检测试剂盒（MTT，Promega）、Lipofectamine（Thermo Fisher Scientific公司 2000CAT.NO.11668-027）、BCA Assay Reagent（美 国 Pierce Chemical公司）、聚偏氟乙烯膜（Millpore公司，Cat NO.IPVH00010）、β-actin antibody（Santa Cruz，sc-4778）、SCD1 antibody（Abcam，ab19862）、E-cadherin（Abcam，ab76055）、β-catenin（Abcam，ab16051）及 N-cadherin（Abcam，ab76057）。 1.4 实验方法

1.4.1 qPCR检测组织mRNA表达水平 将临床组织从液氮中取出，低温并去RNA合酶的条件下研磨组织，加入1 mL Trizol，融化后全部转移至2 mL离心管中，置于冰上裂解5 min，严格按说明书进行RNA抽提，30 μL无核酶水稀释RNA。NanoDrop2000超微量分光光度计检测RNA浓度，取5 μg进行逆转录，Cyber Green qPCR反应体系检测基因表达水平。反应条件：预变性 94℃，4 min，扩增条件 94℃，30 s，60℃，1 min，40个循环。引物序列见表1。 表1 基因引物序列?

1.4.2 构建稳定干扰SCD1的细胞系 （1）病毒包装：将包装质粒[packing质粒（psPAX 2：4.5 μg）和envelop质粒（pMD2.G：1.5 μg）]及目的质粒（6 μg）转入293T细胞，脂质体lipofectamine比例为2.5∶1，使用无血清培养7 h，以促进质粒的转入，24 h及48 h回收病毒悬液，并进行过滤处理。（2）将病毒悬液和培养基以2∶1的比例加入HGC-27细胞中，加入感染增强剂polybrene，感染3 d后使用嘌呤霉素筛选稳定细胞系，并进行蛋白水平的验证。敲除序列为1#：CAGTCACGAGGACTTGGCAGCAG；2#：

AAAGATCCAGACCTTGGCGTGGGCC，对照序列为随机序列：

CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA。1#敲除序列的HCG-27细胞系以siSCD1 1#表示，2#敲除序列的HCG-27细胞系以siSCD1 2#表示，对照序列的HCG-27细

胞系以sicontrol表示。

1.4.3 Western blotting检测细胞中SCD1及EMT相关蛋白（E-cadherin、β-catenin及N-cadherin）表达水平 对数生长期细胞胰酶消化后1 mL含血清培养基终止消化，PBS洗2次后加入300 μL的IP裂解液及蛋白酶抑制剂混合液冰上裂解2 h，BCA法检测蛋白含量并配平，配制10%丙烯酰胺胶，上样量40 μg，恒压80 V跑胶30 min，恒压120 V跑胶1 h，250 mA恒流转至PVDF膜，丽春红染色，剪下目的条带，10%脱脂奶粉封闭1 h，加入相应的一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜；加入相应的二抗（1∶1 000）37℃孵育 1.5 h，发光液曝光显影后于凝胶成像仪，Image Lab 4.0软件分析相应的蛋白条带灰度值。

1.4.4 MTT法检测细胞增殖情况 将构建好的HGC-27以2×103个/孔细胞的浓度接种至96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，同时设置5个复孔，置于5%CO2，37℃培养箱中培养。分别检测细胞0 h、24 h、48 h以及72 h的细胞增殖活力，MTS与培基以1∶9的比例混合均匀，混匀后于培养箱中孵育1 h后于多孔板酶标仪在490 nm检测各组吸光度值。

1.4.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况 （1）包被基底膜：50 mg/L的Matrigel胶稀释液包被Transwell小室底的上室面，4℃风干。（2）水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50 μL含10 g/L的BSA无血清培养液，37℃，30 min。（3）细胞悬液制备：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。（4）接种细胞：取 100 μL 5×105个/mL 细胞加入 Transwell上小室，下室加入600 μL的10%FBS 1640培养基，注意防止气泡产生，置于37℃，5%CO2下培养细胞24 h。（5）细胞染色和计数：0.1%结晶紫染色10 min，泡去多余染液，光镜下计数，计数采用随机视野计数法，400倍镜下观察膜背面侵袭的细胞数，随机计数中间和四周5个视野的总细胞数，求其平均值及标准差。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 qPCR检测组织SCD1表达的差异

胃癌组织中SCD1 mRNA相对表达量为（0.196±0.037），显著高于癌旁组织的（0.076±0.025），差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。 2.2 Western blotting对稳定干扰SCD1表达细胞系的验证

慢病毒转染目的质粒的HGC-27细胞（siSCD1）SCD1蛋白表达量相比对照组（sicontrol）细胞明显下调，见图2A；sicontrol细胞的SCD1相对表达量显著高于siSCD1 1#的表达量及siSCD1 2#的表达量，差异存在统计学意义（P＜0.05），见图2B。稳定干扰SCD1表达的HGC-27细胞系建立成功。 图1 胃癌及癌旁组织中SCD1的mRNA表达水平及比较 图2 siSCD1 HGC-27细胞系中SCD1蛋白表达情况 2.3 siSCD1 HGC-27细胞系增殖能力变化情况

干扰HGC-27细胞的SCD1表达后，培养48 h、72 h细胞的增殖能力与sicontrol组细胞相比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。 图3 siSCD1 HGC-27细胞系增殖能力变化情况 2.4 siSCD1 HGC-27细胞系侵袭能力变化情况

siSCD1 1#（121.9±36.5）个/视野 ，siSCD1 2#（162.4±42.6）个/视野；sicontorl（231.7±49.4）个/视野，干扰HGC-27细胞的SCD1表达后，穿胶细胞数目显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

2.5 EMT相关分子的表达情况

与sicontrol细胞比较，干扰HGC-27细胞的SCD1表达后，E-cadherin表达上调，N-cadherin及β-catenin表达下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

图5 siSCD1 HGC-27细胞系EMT相关分子表达情况 3 讨论

SCD1基因位于染色体19p4.38上，在正常情况下参与机体的脂肪代谢，其表达产物SCD1是脂肪组织和肝脏中脂代谢的关键限速酶，在脂肪酸的组成和脂肪沉积中起着重要作用［5］。近年越来越多的研究表明，脂代谢与恶性肿瘤的存在密切联系，SCD1作为重要的脂代谢酶，也被发现与多种恶性肿瘤的发生发展相关。Noto等［6］在其研究中发现SCD1可促进肺上皮细胞的恶变；Huang等［4］也在报道中指出SCD1可促进非小肺癌细胞的增殖转移，抑制肿瘤细胞的凋亡，不利于患者的预后；Southam等［7］利用重组化疗药物BaP治疗急性髓系白血病（AML）时发现SCD1表达显著下降，众多研究均提示SCD1具有促癌作用。 本研究中，一方面通过利用qPCR技术检测了32例胃癌患者的胃癌组织及其癌旁组织的SCD1 mRNA表达含量，得到胃癌组织中的表达量显著高于癌旁组织（P＜0.05），从正面证实了SCD1的促胃癌作用；另一方面，通过干扰未分化的胃癌细胞系HGC-27中SCD1的表达，得到细胞的增殖能力和侵袭能力均显著下降（均P＜0.05），从反面验证了SCD1的促胃癌作用。EMT是由上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是恶性肿瘤细胞形成及进展过程中的重要组成部分，E-cadherin、N-cadherin及βcatenin的表达可作为衡量EMT过程的标志，E-cadherin是一种上皮细胞表达的重要的黏附分子，恶性肿瘤形成过程中其发生下调意味着细胞间连接减弱，肿瘤细胞转移能力增强［8］。N-cadherin往往在未分化的细胞中表达较高，有研究显示其高表达与细胞EMT过程呈正相关关系［9］。β-catenin可通过多种信号通路促进肿瘤细胞EMT过程的发

生［10］。本研究检测了干扰SCD1表达后HGC-27细胞E-cadherin、N-cadherin及βcatenin的表达，结果显示，E-cadherin表达显著上调（P＜0.05），N-cadherin及 β-catenin表达显著下调（P＜0.05），提示SCD1可能促进胃癌细胞的EMT过程，进而促进侵袭转移能力。

综上所述，SCD1在胃癌细胞的增殖、侵袭及EMT过程的发生均有明显的促进作用，提示SCD1基因是胃癌的潜在促癌基因。 参考文献：

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