基因工程

基因工程：指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

上游技术是指外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术涉及含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养，以及外源基因表达产物的分离纯化过程。

第二章

用于核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸修饰酶

核酸内切酶：在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。

II型限制性内切酶

主要特性：①限制修饰—单功能；②蛋白结构—同源二聚体；③辅助因子—Mg2+；④识别序列—旋转对称序列；⑤切割位点—识别序列内或附近特异性切割

基本特性：①识别双链DNA分子中4～8对碱基的特定序列②大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧③识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 影响活性的因素：

①DNA样品的纯度（蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等）

措施：a.加大酶的用量，1μg DNA用10 U酶；b.加大反应总体积；c.延长反应时间 ②DNA分子构型:不同构型DNA进行酶切时条件不同；同一DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同

③DNA样品的甲基化程度：请看PPT ④酶的缓冲液性质:高浓度的酶和甘油、低离子强度、极端pH值会使核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性 ⑤酶的性质：a.酶的纯度b.酶切反应的温度和时间

DNA连接酶

基本性质:①修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；②修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键（T4-连接黏性末端）③连接多个平头双链DNA分子（T4-连接平头末端）

DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol I）

基本性质：①5’→3’的DNA聚合酶活性②5’→3’的核酸外切酶活性③3’→5’的核酸外切酶活性 基本用途：制备32P标记的探针（杂交探针的制备）

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段Klenow：DNA pol I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端2/3的大肽段） 基本性质：①5’→3’的DNA聚合酶活性②3’→5’的核酸外切酶活性（5’→3’的核酸外切酶活性——无） 基本用途：①补平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；②DNA片段的同位素末端标记

③cDNA第二链的合成；④双脱氧末端终止法测定DNA序列

T4噬菌体DNA聚合酶

基本特性：①5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性；②在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切；③在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；④在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 基本用途：①切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；②DNA片段的同位素末端标记；

Taq DNA聚合酶：①5’→3’聚合酶活性；②5’→3’外切酶活性③最适温度75～80℃，辅助因子Mg2+ 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）：

基本特性：①以RNA为模板聚合cDNA链；②双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链； 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）

基本特性：来自小牛胸腺；不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs

核酸修饰酶

T4-多核苷酸激酶（T4-PNP）

基本特性：在DNA、RNA的5’–OH上加磷（用于探针的末端同位素标记） 碱性磷酸单酯酶——脱磷作用：使DNA或RNA的5’磷酸变为5’–OH末端

第三章

载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，本质是DNA复制子。

质粒：生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成不相容性群

多克隆位点MCS：载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性内切酶的酶切位点的DNA片段 表达质粒载体：在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体 载体应具备的条件：

1. 具有能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制 2. 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

3. 具有合适的筛选标记基因，用于筛选重组体DNA 载体的功能:

1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 （一）质粒

质粒载体：复制必需区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点(多克隆位点)。 （1）质粒的基本特征： 1. 质粒的自主复制性

两大复制类型：① 严紧型复制控制的质粒 1-3拷贝 ② 松弛型复制控制的质粒 10-200拷贝 2. 质粒的不相容性 3. 质粒的可转移性

某些非接合型质粒(ColE Ⅰ)在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由nic和mob基因决定

4.携带特殊的遗传标记——使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状： 物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱 （2）质粒的构建

pSC101 9.09 kb拷贝数1-2 四环素抗性标记基因Tcr ColE1 6.5 kb拷贝数20-30 大肠杆菌内毒素标记基因E1 pSF2124 ColE Ⅰ衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因Apr （3）理想质粒载体的必备条件 ①较小的分子质量和较高的拷贝数

②若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点 ③具有两种以上的选择性标记基因 ④缺失mob基因

⑤插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达

（4）重要的大肠杆菌质粒载体——pUC18/19：正选择标记LacZ的显色原理（蓝白斑筛选） （5）制备质粒DNA的方法：

①氯化铯密度梯度离心法——质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 ②沸水浴法——质粒DNA纯度底、快速、操作简便

③碱溶法——质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间 （二）大肠杆菌的λ噬菌体DNA

（1）λ噬菌体DNA作为载体的优点：

①λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 ②λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量

③重组入-DNA分子的筛选较为方便，提取较为简便

④λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因 （2）λ-DNA载体的构建： ①加装选择标记：

免疫功能类标记：含标记基因λ-载体进入受体——浑浊斑；外源DNA插入标记基因——透明斑 颜色反应类标记：空λ-载体——蓝色透明斑；外源DNA插入标记基因——无蓝色 ②引入无义突变

（3）λ-DNA载体的主要类型：插入灭活型载体、取代型载体 （三）大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA （1）M13 DNA载体的特点：

①使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外——这在DNA定向突变中非常有用

②M13重组分子筛选简便——被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大

③可从大肠杆菌中制备双链DNA，能在体外进行基因克隆 （四）考斯质粒

（1）考斯质粒载体的特点：

①能像入-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 ②能像质粒那样在受体细胞中自主复制 ③重组操作简便，筛选容易

④装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 ⑤不能体内包装，不裂解受体细胞 （五）人工染色体载体

（1）细菌人工染色体（BAC）：50-300 kb；（2）酵母人工染色体（YAC）：350-400 kb （六）受体细胞

（1）受体细胞应具备的条件：

①限制性缺陷型——外切酶和内切酶活性缺陷（ recB- ， recC- ， hsdR- ） ②重组整合缺陷型——用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA- ） ③具有较高的转化效率

④具有与载体选择标记互补的表型

⑤感染寄生缺陷型——防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 （2）各种基因工程受体的特性

①大肠杆菌——外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌

②枯草杆菌——原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌 ③链霉菌——抗生素生产菌株的改良

④酵母菌——外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌

⑤哺乳动物细胞CHO--哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，DNA重组实验的哺乳动物受体 ⑥植物细胞（拟南芥菜、烟叶）——高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良

第四章

核酸的提取与纯化

基本特性：在DNA、RNA的5’–OH上加磷（用于探针的末端同位素标记）

三大步骤：①细胞的破碎；②除去与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质；③除去其它杂质核酸，获得均一的样品 1.样品预处理：样品应该新鲜；取样后立即低温处理（-20℃或-70℃）冷冻保存 2.消化与裂解细胞：不同生物细胞的消化和裂解有不同的办法，如酶解法、碱裂解法、煮沸法、有机溶剂抽提法。 SDS法：利用高浓度的SDS（十二烷基硫酸钠）在较高温度（55～65℃）下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性、释放出核酸，提高盐浓度和降低温度沉淀蛋白质和多糖。

CTAB法：CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，适用于植物组织、真菌等核酸的提取。可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物。在高盐溶液（0.7mol/L）中可溶，降低盐浓度（0.3mol/L），核酸析出。 优点：（1）能很好的去除糖类杂质，适用于含糖量的材料；（2）能同时得到高质量的DNA和RNA

核酸的检测与保存（浓度检测、纯度检测、完整性检测）

浓度检测：①紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。（A260×稀释倍数×50＝ μg/ml——A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA或RNA，20μg/ml单链寡核苷酸） 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。

②荧光光度法：荧光染料DAPI可专一性地形成DNA-DAPI荧光复合物，其荧光强度与溶液中的核酸含量呈正比。

适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）

纯度检测——紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份，高于此值表明有RNA的残留量。

纯的DNA的A260与A280之比应在1.80；纯的RNA的A260与A280之比应在2.0。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。

完整性检测——凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。

DNA的保存：①短期保存：4℃/-20℃存放于TE（Tris-HCl和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的pH与DNA贮存有关，pH为8时，可减少DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。

②长期保存：TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌的污染。

RNA的保存:①RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70℃保存；②RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存；③RNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制RNA酶对RNA的降解。

电泳（带电物质在电场中向相反方向电极移动的现象）

①琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；DNA分子在电泳时，有电荷效应与分子筛效应；不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同区带。

影响琼脂糖凝胶电泳的因素： 1.凝胶的浓度：根据检测的DNA分子大小； 2.DNA分子大小与构象：超螺旋DNA>开环DNA>线状DNA； 3.电泳缓冲液：TAE（40 mol/L Tris-乙酸、1 mmol/L EDTA）;TBE( 90 mol/L Tris-硼酸、1 mmol/L EDTA） 4.加DNA样品：<1μg，指示剂； 5.电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 6.染色和观察：EB染色，在300nm波长的紫外下观察，能看到0.05μg的微量DNA

②聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N＇-亚甲双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N＇,N＇-四甲基乙二胺（TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 （分辨率高，适用于低分子DNA（1-500bp）、蛋白质，寡聚核苷酸的分离和DNA的序列分析） 特性：

1.凝胶透明，有弹性，机械性能好，化学性能稳定，与被分离物无化学反应，对pH和温度变化较稳定； 2.回收的DNA样品纯度极高；3.无吸附和电渗作用，若Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 4.样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；

5.凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 6.分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。在同一个DNA混合物中，1bp与500bp也能很好的分离。

第五章&第六章&第七章

引物：人工合成的两段寡核苷酸序列，是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。一条引物与目的区域一端的一条DNA模板链互补,另一条引物与目的区域另一端的另一条DNA模板链互补。 基因文库：通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官/细胞类型所有DNA片段构成的克隆集合体。 根据构建方法不同，基因文库分为：①基因组文库—全部基因②cDNA文库—含有全部蛋白质编码的结构基因

基因文库的完备性：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N = In (1-P) / In(1-f)

用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA；用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA （一）PCR法（聚合酶链反应）

（1）PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物 （2）PCR技术的原理

①变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA。

②退火：是模板与引物的复性。（一般采用较引物Tm值低5 ℃作为PCR退火温度） ③延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，碱基配对形式按5'→3'方向沿着模板顺序合成新的DNA链。 （2）引物的重要性

①PCR的特异性要求引物与靶DNA特异性结合，不与其他非目的DNA结合；

②PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，引物设计好坏与PCR结果密切相关。 （3）引物设计的一般原则

①引物长度特异性通过引物长度和退火温度控制。 ②Tm值：一般要求：55℃-65℃

③碱基分布的均衡性：同一碱基连续出现不应超过5个，GC含量一般40-60 % ④引物3’端：3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对 （二）cDNA法 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成

①自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 ②置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 ③引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列 （1）双链cDNA的克隆——克隆入载体的方法： ①平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收

②平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段

③加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 （2）cDNA法克隆目的基因的局限性：

①并非所有的mRNA分子都具有poly A结构 ②细菌或原核生物的mRNA半衰期很短

③mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难 ④仅限于克隆蛋白质编码基因

（3）基因文库的构建程序——基因组DNA的切割

用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：①保证DNA片段之间存在部分重叠区； ②保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头

部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，酶解片段的大小可控（Sau3Al、Mbol）

连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体! （4）理想的基因文库应具备下列条件： ①尽可能高的完备性

②重组克隆的总数不宜过大——以减轻筛选工作的压力

③载体的装载量最好大于基因的长度——避免基因被分隔克隆 ④克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域——以利克隆排序 ⑤克隆片段易于从载体分子上完整卸下 ⑥重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 （5）从基因文库中筛选目的基因

常用方法：①抗药性筛选法； ②酵母双杂交技术

在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接 （6）为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： ①将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 ②用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 ③用TdT酶在DNA片段的末端_上增补同聚尾末端

第八章&第九章

DNA的体外重组（切与接）——看PPT的具体例子

（一）粘性末端DNA分子间的连接—同种内切酶生产的粘性末端的连接；同尾酶生产的粘性末端的连接。 （二）平头末端DNA…↑—不同粘性末端的连接；人工粘性末端的连接①5’突出末端②3’突出末端③平头末端 重组率：衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。 重组率=含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数（重组率一般为25～75%） 提高重组率的方法：①提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1—10:1； ②载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团；③加装同聚尾末端 （一）基因转移（转化） （1）大肠杆菌感受态

大肠感受态细胞制备：冰浴放置12～24小时备用；大肠感受态细胞的质粒转化：在42℃保温90秒（热脉冲） （2）电击法（电穿孔转化）

（二）筛选①直接筛选：DNA鉴定、载体筛选②间接筛选：翻译产物、转录产物、其他③载体表型特征筛选 ①抗药性标记插入失活筛选法：

基本原理：可区分转化子与非转化子，重组子与非重组子 将外源DNA片段插在 EcoR Ⅰ 位点：

非重组子呈：Apr、Tcr 重组子呈：Apr、Tcr 将外源DNA片段插在 BamH Ⅰ 位点：

非重组子呈：Apr、Tcr 重组子呈：Apr、Tcs ②显色筛选法：

可区分转化子与非转化子，重组子与非重组子

基本原理：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。 ③营养缺陷型筛选法：

可区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子

基本原理：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。

④限制性酶切图谱法：

可区分重组子与非重组子，还能鉴定目的重组子

基本原理：对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，但工作量大。 ⑤全酶解图谱法:

1.区分重组子与非重组子：

用BamHⅠ酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段 重组子：2.7 kb + 4.0 kb 非重组子：2.7 kb

如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好选用单一-切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子 如果外源DNA片段插在pUC18的SphⅠ位点处，原则上也可用SphⅠ酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphⅠ非常昂贵。用HindⅢ和EcoIⅠ联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphⅠ的1 / 50 2.区分目的重组子与非目的重组子

用EcoRⅠ酶切转化子质粒

DNA目的重组子：3.0 kb + 3.7 kb 或 1.0 kb + 5.7 kb 用PstⅠ酶切转化子质粒DNA

目的重组子：3.2 kb + 3.5 kb 或 0.8 kb + 5.9 kb

区分目的重组子与非目的重组子：对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRⅠ酶切开后，只出现2.0 kb和2.7 kb两条带子，实际上2.0 kb的条带中含有两种不同的分子。 ⑥菌落噬菌斑原位杂交法： 原理：根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。 （三）转化细胞的扩增操作的目的：

①增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 ②扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 ③表达外源基因，便于筛选和鉴定

第十章——大肠杆菌基因工程

一.大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势：①全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；②基因克隆表达系统成熟完善；③繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；④被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 劣势：①缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；②缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 ③内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；④细胞周质内含有种类繁多的内毒素

核糖体结合位点（RBS）：外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点

外源基因上密码子在大肠中获最佳表达：①外源基因全合成（更换同义密码子）②同步表达相关tRNA编码基因 二.大肠杆菌基因工程菌的构建策略

表达的形式：①包涵体型异源蛋白的表达；②分泌型异源蛋白的表达；③融合型异源蛋白的表达；④寡聚型异源蛋白的表达；⑤整合型异源蛋白的表达；⑥蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建

包涵体:在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构。

包涵体表达形式的优点：①能简化外源基因表达产物的分离操作②能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 缺点：当目标蛋白分子中的半胱氨酸残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%

融合蛋白：除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达，表达得到的蛋白质为融合蛋白。 三.工程菌遗传不稳定性

表现形式：①结构不稳定性②分配不稳定性

产生机制：①受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解 ②外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢（能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序）

③重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配（这是重组质粒逃逸的基本原因） ④受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排

宏观逃逸率：当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比

改善基因工程菌不稳定性的策略：

①改进载体受体系统——以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括： a.将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞；

b.正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内；

c.将受体细胞的致死性基因安装在载体上，构建条件致死性的相应受体系统(大肠杆菌的ssb基因-DNA单链结合

蛋白编码基因) ②施加选择压力

a.根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素(药物和食品生产时禁止使用抗生素) b.根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组分(培养基复杂，成本较高) ③控制目的基因的过量表达

a.使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 b.使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 ④优化基因工程菌的培养工艺

a.培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 b.培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定