一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物及多重实时荧光PCR方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 106811535 A(43)申请公布日 2017.06.09

(21)申请号 201710136218.3(22)申请日 2017.03.08

(71)申请人 青岛捷安信检验技术服务有限公司

地址 266000 山东省青岛市崂山区株洲路

168号(72)发明人 张鹏　宋智斌　王萌竹　官宁　

张加美　(74)专利代理机构 青岛中天汇智知识产权代理

有限公司 37241

代理人 赵翠(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/14(2006.01)C12Q 1/10(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)

()发明名称

一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物及多重实时荧光PCR方法(57)摘要

本发明涉及一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物，包括表1中所示的SEQ ID No.1-15的序列引物序列或探针序列；所述各探针序列的5’端均修饰有报告基团，3’端均修饰有淬灭基团；所述报告基团有：FAM、FITC、HEX、JOE、CY3，淬灭基团有：TAMRA，BHQ、Eclipse。本发明的一种五重实时荧光定量PCR的检测方法，可在同一反应体系中，同时检测沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌五种致病菌。且运用五重实时荧光定量PCR法对这五种致病菌进行检测，可提高检测的灵敏度、特异性、并可大幅度的提高检测效率，弥补了常规检测所存在的步骤复杂、检测周期长，不能适应大规模快速检测的缺陷。

C12R 1/42(2006.01)C12R 1/63(2006.01)C12R 1/445(2006.01)C12R 1/01(2006.01)

权利要求书1页 说明书11页

序列表3页 附图1页

CN 106811535 ACN 106811535 A

权　利　要　求　书

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1.一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物，其特征在于，包括序列表中SEQ ID No.1-15的序列，其中SEQ ID No.1、2、4、5、7、8、10、11、13、14分别为引物序列invA-F、invA-R、vvhA-F、vvhA-R、ipaH-F、ipaH-R、nuc-F、nuc-R、prfA-F、prfA-R，SEQ ID No.3、6、9、12、15分别为探针序列invA-P、vvhA-P、ipaH-P、nuc-P、prfA-P；所述各探针序列的5’端均修饰有报告基团，3’端均修饰有淬灭基团；所述报告基团有：FAM、FITC、HEX、JOE、CY3，淬灭基团有：TAMRA，BHQ、Eclipse；所述五种致病菌为沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。

2.根据权利要求1所述的同时检测五种致病菌的引物探针组合物，其特征在于，所述SEQ ID No.1-15的序列，应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中各序列的用量为invA-F 0.6μM、invA-R 0.6μM、invA-P 0.3μM、vvhA-F 0.4μM、vvhA-R 0.4μM、vvhA-P 0.3μM、ipaH-F 0.6μM、ipaH-R 0.6μM、ipaH-P 0.7μM、nuc-F 0.4μM、nuc-R 0.4μM、nuc-P 0.3μM、prfA-F 0.3μM、prfA-R 0.3μM、prfA-P 0.4μM。

3.一种同时检测五种致病菌的多重实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、提取待检样本的基因组DNA，备用；(2)、将提取的基因组DNA作为模板加入到五重实时荧光定量PCR反应体系中，所述反应体系为：Taq酶1-4U、Mg2+5mM、dNTP 300μM、pH8.3的Tris-HCl 100mM、KCl 500mM、invA-F 0.6μM、invA-R 0.6μM、invA-P 0.3μM、vvhA-F 0.4μM、vvhA-R 0.4μM、vvhA-P 0.3μM、ipaH-F 0.6μM、ipaH-R 0.6μM、ipaH-P 0.7μM、nuc-F 0.4μM、nuc-R 0.4μM、nuc-P 0.3μM、prfA-F 0.3μM、prfA-R 0.3μM、prfA-P 0.4μM、模板100-200ng，补水至25μL；

(3)、将反应体系放置于荧光定量PCR仪中，反应程序为95℃25s→95℃3s，60℃25-60s，40个循环；收集PCR扩增过程中的荧光信号，若待测样本中某基因的Ct值小于36，则判断该样本含拥有该基因的致病菌；若待测样本中某基因的Ct值大于等于36，则判断该样本不含有拥有该基因的致病菌。

4.一种同时检测五种致病菌的试剂盒，其特征在于，主要包括荧光定量2×PCR mix，所述2×PCR mix包含以下组份：Taq酶2-8U、Mg2+10mM、dNTP 600μM、pH8.3的Tris-HCl 200mM、KCl 1000mM、invA-F 1.2μM、invA-R 1.2μM、invA-P 0.6μM、vvhA-F 0.8μM、vvhA-R 0.8μM、vvhA-P 0.6μM、ipaH-F 1.2μM、ipaH-R 1.2μM、ipaH-P 1.4μM、nuc-F 0.8μM、nuc-R 0.8μM、nuc-P 0.6μM、prfA-F 0.6μM、prfA-R 0.6μM、prfA-P 0.8μM。

5.根据权利要求4所述的同时检测五种致病菌的试剂盒，其特征在于，其使用方法为：吸取PCR mix 12.5μL，加入100-200ng DNA模板，补水至25μL组成PCR反应体系。

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一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物及多重实时荧光

PCR方法

技术领域[0001]本发明涉及一种快速、同时检测沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的引物探针组合物以及多重实时荧光PCR的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术[0002]沙门氏菌(Salmonella)、创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)、志贺氏菌(Shigella Castellani)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是五种常见的食源性致病菌，也是我国食品国家卫生标准中致病菌检测的5项重要指标。其中沙门氏菌是是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。创伤弧菌广泛分布在海水中，可从牡蛎等海产品中分离得到。本菌主要通过伤口接触海水造成感染，也可经口感染。经伤口感染时可导致蜂窝织炎及骨髓炎等多种炎症，经口感染时常迅速导致菌血症或败血症。感染本菌后如不及时治疗，病死率很高。志贺氏菌通称痢疾杆菌，是引起人类细菌性痢疾的主要病原菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。现阶段国家标准中对上述致病菌的检测主要依靠传统的细菌培养、生化鉴定的方法，步骤复杂、检测周期长，已不能完全适应大规模快速检测的需要。近些年来，随着分子生物学的发展，PCR和实时荧光定量PCR技术逐渐走进食品中致病菌的检测。而且实时荧光定量PCR与常规PCR相比，它具有特异性更强、检测周期短、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。由于多重实施荧光定量PCR引物之间的交叉影响，Mg2+的浓度、不同引物探针所需添加量的不同等因素的存在。致使现阶段运用实时荧光定量PCR检测多是单重实时荧光定量PCR检测法，可同时检测多个目的基因的检测体系较少，因此，建立一种以多重实时荧光定量PCR为基础的食品中沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的快速同时检测方法是具有实践意义的。发明内容[0003]本发明的目的是提供一种可同时鉴别沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的引物探针组合物，该组合物能快速的鉴别沙门氏菌的特异性invA基因、创伤弧菌的特异性vvhA基因、志贺氏菌的特异性ipaH基因、金黄色葡萄球菌的特异性

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nuc基因，单增李斯特菌的特异性prfA基因，特异性强，灵敏度高。[0004]一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物，包括表1中所示的SEQ ID No.1-15的序列，其中SEQ ID No.1、2、4、5、7、8、10、11、13、14分别为引物序列invA-F、invA-R、vvhA-F、vvhA-R、ipaH-F、ipaH-R、nuc-F、nuc-R、prfA-F、prfA-R，SEQ ID No.3、6、9、12、15分别为探针序列invA-P、vvhA-P、ipaH-P、nuc-P、prfA-P；所述各探针序列的5’端均修饰有报告基团，3’端均修饰有淬灭基团；所述报告基团有：FAM、FITC、HEX、JOE、CY3，淬灭基团有：TAMRA，BHQ、Eclipse；所述五种致病菌为沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。[0005]表1本发明同时检测五种致病菌的引物探针组合物

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进一步地，所述SEQ ID No.1-15的序列，应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中各序列的用量为invA-F 0.6μM、invA-R 0.6μM、invA-P 0.3μM、vvhA-F 0.4μM、vvhA-R 0.4μM、vvhA-P 0.3μM、ipaH-F 0.6μM、ipaH-R 0.6μM、ipaH-P 0.7μM、nuc-F 0.4μM、nuc-R 0.4μM、nuc-P 0.3μM、prfA-F 0.3μM、prfA-R 0.3μM、prfA-P 0.4μM。以上引物探针用量，均于建立五重实施荧光定量PCR反应体系时，经实验验证，在此浓度下此反应体系才能最好的扩增各目的基因。否则会出现扩增不充分、反应失败等严重后果。[0009]本发明的另一目的是提供一种同时检测五种致病菌的多重实时荧光PCR方法，包括以下步骤：

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(1)、提取待检样本的基因组DNA，备用；

[0011](2)、将提取的基因组DNA作为模板加入到五重实时荧光定量PCR反应体系中，所述反应体系为：Taq酶1-4U、Mg2+5mM、dNTP 300μM、pH8.3的Tris-HCl 100mM、KCl 500mM、invA-F 0.6μM、invA-R 0.6μM、invA-P 0.3μM、vvhA-F 0.4μM、vvhA-R 0.4μM、vvhA-P 0.3μM、ipaH-F 0.6μM、ipaH-R 0.6μM、ipaH-P 0.7μM、nuc-F 0.4μM、nuc-R 0.4μM、nuc-P 0.3μM、prfA-F 0.3μM、prfA-R 0.3μM、prfA-P 0.4μM、模板100-200ng，补水至25μL；[0012](3)、将反应体系放置于实时荧光定量PCR仪中，反应程序为95℃25s→95℃3s，60℃25-60s，40个循环；收集PCR扩增过程中的荧光信号，若待测样本中某基因的Ct值小于36，则判断该样本含拥有该基因的致病菌；若待测样本中某基因的Ct值大于等于36，则判断该样本不含有拥有该基因的致病菌。[0013]一种同时检测五种致病菌的试剂盒，主要包括荧光定量2×PCR mix，所述2×PCR mix包含以下组份：Taq酶2-8U、Mg2+10mM、dNTP 600μM、pH8.3的Tris-HCl 200mM、KCl 1000mM、invA-F 1.2μM、invA-R 1.2μM、invA-P 0.6μM、vvhA-F 0.8μM、vvhA-R 0.8μM、vvhA-P 0.6μM、ipaH-F 1.2μM、ipaH-R 1.2μM、ipaH-P 1.4μM、nuc-F 0.8μM、nuc-R 0.8μM、nuc-P 0.6μM、prfA-F 0.6μM、prfA-R 0.6μM、prfA-P 0.8μM。[0014]进一步地，上述同时检测五种致病菌的试剂盒，其使用方法为：吸取PCR mix 12.5μL，加入100-200ng DNA模板，补水至25μL组成PCR反应体系。[0015]本发明分别针对沙门氏菌的特异性invA基因、创伤弧菌的特异性vvhA基因、志贺氏菌的特异性ipaH基因、金黄色葡萄球菌的特异性nuc基因，单增李斯特菌的特异性prfA基因设计特异性上下游引物，以及各基因不同荧光素标记的Taqman探针，并采用实时荧光定量PCR技术，对DNA分子进行标记，可实现对相关基因及致病菌的快速准确检测。[0016]本发明的一种多重实时荧光定量PCR的检测方法，可在同一反应体系中，同时检测沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌五种致病菌。且运用五重实时荧光定量PCR法对这五种致病菌进行检测，可提高检测的灵敏度、特异性、并可大幅度的提高检测效率，弥补了常规检测所存在的步骤复杂、检测周期长，不能适应大规模快速检测的缺陷。

附图说明[0017]图1五重实时荧光定量PCR扩增曲线。

具体实施方式[0018]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0019]下述实施例中，所用实验材料，试剂与仪器如下：[0020](1)、实验材料[0021]DNAiso Reagent*：日本TAKARA公司(9770Q)；[0022]Premix Ex Taq(2×)(Tli RNaseH Plus)，ROX plus*：日本TAKARA公司(RR39LR)；[0023]RNA酶(RT405-01)、蛋白酶K(10401ES60)、溶菌酶(A0702)等：购于青岛百木生生物

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有限公司；[0024]引物与双标记Taqman探针均委托TAKARA公司合成。[0025](2)、仪器与设备[0026]实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司，ABI7500Fast；[0027]高速离心机：湘仪TG16-WS；[0028]全自动核酸提取仪：杭州博日科技有限公司NPA-32+；[0029]超微量分光光度计：eppendorf(AG22331Hamburg)。[0030]实施例1引物及探针的设计[0031]依据沙门氏菌invA基因序列(geneID：12419)、创伤弧菌vvhA基因序列(gene ID：2827959)、志贺氏菌ipaH基因序列(gene ID：3776622)、金黄色葡萄球菌nuc基因序列(gene ID：767621)、单增李斯特菌prfA基因序列(gene ID：2744465)，利用引物设计软件PrimerExpress3.0，我们分别设计沙门氏菌的特异性invA基因、创伤弧菌的特异性vvhA基因、志贺氏菌的特异性ipaH基因、金黄色葡萄球菌的特异性nuc基因，单增李斯特菌的特异性prfA基因的上下游引物，以及各基因不同荧光素标记的Taqman探针。[0032]对所设计的引物进行以下分析：引物间的干扰，发卡结构和二聚体。并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。经筛选，排除了引物自身及引物之间存在互补序列、扩增产物的单链能形成二级结构的引物，选留如表1所示的引物及探针序列。[0033]对表1的5对引物对进行单一荧光定量PCR验证，单一PCR采用25μL反应体系：0.25μL(5U/μL)Taq酶，0.375μL(5U/μL)UNG酶，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTPs混合物，2.5μL MgCl2(25mM)，正反向引物各1μL，探针2μL，模板DNA 2μL(DNA浓度为50ng/μL)，加双蒸水补足至25μL。所加引物终浓度均为0.2pmol/μL。[0034]经实验验证，沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的单重检测结果如表2：[0035]表2单一荧光定量PCR引物验证结果

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结果表明实验所设计的引物探针均能够满足检测要求。[0038]实施例2多重荧光定量PCR最佳反应条件的确定[0039]采用表1中的引物、探针及多重实时荧光定量PCR检测方法检测沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的方法步骤如下：

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(1)DNA提取：

[0041]沸水浴法提取细菌DNA。具体操作为挑取琼脂上纯培养的单个菌落加入100μL灭菌的双蒸水中，震荡混匀后置沸水浴中煮沸10min，室温静置，至其降至室温后12000r/min离心2min，取上清于-20℃保存备用。[0042](2)单重实时荧光定量PCR体系的建立及条件优化[0043]用TAKARA的Premix Ex Taq试剂作为反应体系，选定不同的退火温度：[0044]PCR反应条件一为：95℃预变性1min，95℃变性3s，55℃退火后延伸1min。[0045]PCR反应条件二为：95℃预变性1min，95℃变性3s，60℃退火后延伸1min。[0046]PCR反应条件三为：95℃预变性1min，95℃变性3s，62℃退火后延伸1min。[0047]每个反应体系均在退火阶段收集荧光，40个循环。随后对五个基因的引物探针的浓度进行优化，引物浓度优化范围为0.1μmol/L-1.0μmol/L，梯度为0.1μmol/L。探针浓度优化范围为0.1μmol/L-1.0μmol/L，梯度为0.1μmol/L。根据扩增曲线的Ct值和△Rn值来选择适宜的引物和探针浓度组合。[0048]当退火温度为55℃时，五个基因均未出现平滑的扩增曲线，当退火温度为62℃时，invA基因、nuc基因、prfA基因出现△Rn值偏低，Ct值增大等现象。因此本发明所选的PCR反应条件为：95℃预变性1min，95℃变性3s，60℃退火后延伸1min，退火阶段收集荧光，40个循环。在这个反应条件下，五个基因均能扩增出Ct值偏低，△Rn值最大且扩增曲线平滑的结果。[0049]经比较Ct值、△Rn值以及扩增曲线。最终确定五个基因的引物探针浓度范围为：invA基因的引物浓度为0.3μmol/L-0.7μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L-0.4μmol/L；vvhA基因的引物浓度为0.2μmol/L-0.5μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L-0.4μmol/L；ipaH基因的引物浓度为0.3μmol/L-0.7μmol/L，探针浓度为0.6μmol/L-0.8μmol/L；nuc基因的引物浓度为0.3μmol/L-0.7μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L-0.5μmol/L；prfA基因的引物浓度为0.3μmol/L-0.6μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L-0.5μmol/L。PCR反应体系为TAKARA的Premix Ex taq试剂12.5μL，相应量的各个引物探针组合，模板2μL(DNA浓度为50ng/μL)，加无RNA酶水至25μL。[0050](3)五重实时荧光定量PCR的建立及条件优化[0051]3.1引物、探针浓度的优化[0052]PCR反应体系为TAKARA的Premix Ex Taq试剂12.5μL，以五种细菌基因组DNA混合液为模板进行多重实时荧光定量PCR实验，各基因组DNA在PCR反应体系中的量均为100ng，相应量的各个引物探针组合，加无RNA酶水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性1min，95℃变性3s，60℃退火后延伸1min，退火阶段收集荧光，40个循环。在单重实时荧光定量PCR的基础上，取合理的引物探针浓度组合进行优化。先确定invA基因和vvhA基因的最佳引物探针浓度，再以此为基础确定ipaH基因的引物探针最佳浓度，建立三重实时荧光定量PCR反应体系。然后在此三重实时荧光定量PCR的基础上确定nuc基因的最佳引物探针浓度，建立四重实时荧光定量PCR，最后以此四重实时荧光定量PCR为基础，确定prfA基因的引物探针浓度。在优化引物探针的浓度时，选择上下游引物浓度均相同，以Ct值最小、△Rn值最大且扩增曲线平滑、有明显的对数期和平台期时最低引物和探针浓度为标准来进行选取最佳的引物探针浓度。

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经实验发现，invA基因和vvhA基因在同一反应体系中，可同时扩增。当invA基因引

物浓度为0.6μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L，vvhA基因引物浓度为0.4μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L时，两者的Ct值较低且△Rn值较高、有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期；同时两基因的Ct值和△Rn值差异性最小，扩增效率最接近，因此确定为最佳双重实时荧光定量PCR的引物探针浓度。当加入ipaH基因的引物探针时，于引物浓度为0.6μmol/L，探针浓度为0.7μmol/L处，三基因在同一反应中△Rn值差异性最小，且invA基因和vvhA基因的Ct值和△Rn值及扩增曲线与双重时最相似。当加入nuc基因的引物探针时，于引物浓度为0.4μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L处，Ct值较低且△Rn值较高、有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期；且invA基因、vvhA基因和ipaH基因的Ct值和△Rn值及扩增曲线与三重时最相似。当加入prfA基因的引物探针时，于引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.4μmol/L处，Ct值较低且△Rn值较高、有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期；且invA基因、vvhA基因、ipaH基因和nuc基因的Ct值和△Rn值及扩增曲线与四重时最相似。因此本发明最终的引物探针组合为：invA基因引物浓度为0.6μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L；vvhA基因引物浓度为0.4μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L；ipaH基因的引物浓度为0.6μmol/L，探针浓度为0.7μmol/L；nuc基因的引物浓度为0.4μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L；prfA基因的引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.4μmol/L。[00]3.2Mg2+和Taq DNA聚合酶浓度优化[0055]Mg2+浓度优化范围为1.0mmol/L-9.0mmol/L，梯度为1.0mmol/L，DNA聚合酶优化范围扩大为1.0U-5.0U，梯度为1.0U；实验结果显示当Mg2+浓度为5.0mmol/L，Taq DNA聚合酶浓度为4U时，反应所得结果最优，因此最终得到的五重实时荧光定量PCR反应体系如下表所示：[0056]表3五重实时荧光定量PCR反应体系

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反应条件为95℃预变性1min，95℃变性3s，60℃退火后延伸1min，退火阶段收集荧

光，40个循环。五重实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示，所检五种致病菌目的基因均有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期，且Ct值均小于36，说明本反应体系可满足五重实时荧光定量PCR的反应要求。[0060]待测样本检测结果判定：[0061]①若测试样品中某基因的Ct值小于36，则判断该样品含拥有该基因的致病菌。[0062]②若测试样品中某基因的Ct值大于等于36，则判断该样品不含有拥有该基因的致病菌。[0063]实施例3对五种致病菌的特异性检测[00](1)为了验证探针及引物的性能，进行特异性试验：[0065]将40种已知菌株快速扩增后，分别使用单重和多重实时荧光定量PCR方法(采用实

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施例2确定的PCR体系及反应条件)对目标致病菌进行检测。使用特异性引物及探针对相应的目标致病菌进行单重实时荧光定量PCR反应，所检基因的Ct值均小于36，使用混合引物探针对这40种已知菌株进行多重实时荧光定量PCR检测，检测结果与设计完全相符：五种目标致病菌均出现相应报告基团的扩增，对其他已知菌株均未出现扩增情况。[0066]表4多重实时荧光定量PCR检测的特异性检测

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通过以上结果可以看出，5对引物、探针仅针对相对应的致病菌具有Ct值，且Ct值

均小于36；而其他样本没有扩增。由此可见本实验设计的引物探针具有很高的物种特异性。[0070](2)基因组DNA灵敏度试验[0071]根据国标GB47.2-2010《食品微生物检验-菌落总数测定》计数当前所用菌液中菌落形成单位数，无菌操作将其稀释成100cfu/ml-1010cfu/ml系列浓度梯度后，用沸水浴法提取DNA模板，取各浓度菌液模板2μL(DNA浓度为50ng/μL)进行实时荧光PCR扩增，并依据浓度梯度的扩增曲线Ct值，计算该方法的检出限。[0072]结果显示，当菌液浓度小于102cfu/ml时，invA基因、vvhA基因、ipaH基因、nuc基

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因、prfA基因都未出现扩增曲线，表明浓度已经超出了本方法所能检测的限度。因此该方法对invA基因、vvhA基因、ipaH基因、nuc基因、prfA基因的检出限为102cfu/ml。[0073](3)重复性试验验证[0074]分别提取沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的DNA，每种致病菌提取3个样本DNA，按照上述优化好的体系、PCR条件进行五重实时荧光定量PCR，每个样本进行3次复孔的重复，考察方法的稳定性，结果如表5。[0075]表5多重实时荧光定量PCR检测的重复性验证

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表5中Ct mean表示Ct的平均值，Ct SD表示Ct的标准方差，从表5中可以看出，每个

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样本的3次重复实验的Ct值的标准方差均小于0.5，说明检测结果的重复性好，检测的稳定性高。[0079]本方法所采用的五重实施荧光定量PCR法，可在同一反应体系中同时检测五种致病菌，不但弥补了传统检测所需的细菌培养、生化鉴定的方法中存在的步骤复杂、检测周期长、不适用于大规模检测等缺点，还在实施荧光定量PCR检测的基础上，将工作效率提高了五倍。大大提升了对这五种致病菌检测的效率。[0080]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

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SEQUENCE LISTING<110> 青岛捷安信检验技术服务有限公司<120> 一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物及多重实时荧光PCR方法<130> 2017<160> 15<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 17<212> DNA<213> Salmonella<400> 1ttaatgcatc ggccagc 17<210> 2<211> 18<212> DNA<213> Salmonella<400> 2ggtcgacgat caccggtc 18<210> 3<211> 29<212> DNA<213> Salmonella<400> 3tcaatgcgtt ggaaaggatc actagctgt 29<210> 4<211> 20<212> DNA<213> Vibrio Vulnificus<400> 4ccgcggtaca ggttggcgca 20<210> 5<211> 19<212> DNA<213> Vibrio Vulnificus<400> 5cgccacccac tttcgggcc 19<210> 6<211> 20

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<212> DNA<213> Vibrio Vulnificus<400> 6ccgagccgga accgacggag 20<210> 7<211> 22<212> DNA<213> Shigella Castellani<400> 7tccgatccgt ctgtgcgcac aa 22<210> 8<211> 22<212> DNA<213> Shigella Castellani<400> 8agcgaaagat gctgtcgaag ct 22<210> 9<211> 28<212> DNA<213> Shigella Castellani<400> 9attccgtgaa caggtcgctg catggctc 28<210> 10<211> 32<212> DNA<213> Staphylococcus aureus<400> 10cgcatctagt tgcttagtct taactttagt tg 32<210> 11<211> 28<212> DNA<213> Staphylococcus aureus<400> 11tgcactatat actgttggat cttcagaa 28<210> 12<211> 33<212> DNA<213> Staphylococcus aureus<400> 12

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tgcatcacaa acagataacg gcgtaaatag aag 33<210> 13<211> 21<212> DNA<213> Listeria monocytogenes<400> 13gatacagaaa catcggttgg c 21<210> 14<211> 21<212> DNA<213> Listeria monocytogenes<400> 14gtgtaatctt gatgccatca g 21<210> 15<211> 25<212> DNA<213> Listeria monocytogenes<400> 15attgttcttc caccgtgatt ccgaa 25

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图1

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