中外医疗China&ForeignMedicalTreatmentDOI院10.16662/j.cnki.1674-0742.2018.27.0182018NO.27数字PCR检测cfDNA中KRAS突变的灵敏度研究1.复旦大学生命科学学院袁上海200438曰2苏州溯源精微生物科技有限公司袁江苏苏州信息技术研究所袁上海200042罗宇文1袁2袁李瑶1袁景奉香3215300曰3.中国科学院上海微系统与[摘要]目的该文旨在研究一种适用于数字PCR在KRAS基因突变液态活检中的灵敏度评价方法袁并通过临床样本的检测结果验证灵敏度算法的可行性遥方法2016年11月基于微滴式数字PCR平台设计引物探针建立KRAS检测方法袁确定其检测下限尧定量下限尧变异系数遥2017年1月比较了数字PCR3种不同检测下限统计算方法遥结果成功建立微滴式数字PCR对KRAS突变检测方法遥在3种检测下限计算方法结果对比后选择了保守性居中的算法遥结论数字PCR是一种灵敏精确的基因突变检测方法袁其检测下限可使用基于假阳性率的泊松分布算法进行量化评价袁且综合检测性能适用于临床液态活检的需求遥[关键词]KRAS曰微滴式数字PCR曰检测下限[中图分类号]R473.6[文献标识码]A[文章编号]1674-074圆渊圆园员8冤09渊c冤原园018-03StudyonSensitivityofDigitalPCRforDetectionofKRASMutationincfD鄄NALUOYu-wen1,2,LIYao1,JINGFeng-xiang31.SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai,200438China;2.SuzhouSuyuanMicrobiologyTechnologyCo,Ltd,Suzhou,JiangsuProvince,215300China;3.ShanghaiInstituteofMicrosystemandInformationTechnology,ChineseAcade鄄myofSciences,Shanghai,200042China[Abstract]ObjectiveThispapertriestostudyasensitivityevaluationmethodsuitablefordigitalPCRinKRASgenemuta鄄tionliquidbiopsy,andverifythefeasibilityofsensitivityalgorithmbythetestresultsofclinicalsamples.MethodsInNovember2016,aprimerprobewasdesignedbasedonthemicrodropletdigitalPCRplatformtoestablishaKRASdetectionmethodtodeterminethelowerlimitofdetection,thelowerlimitofquantitation,andthecoefficientofvariation.InJanuary2017,thecalculationmethodsofthreedifferentdetectionlowerlimitsofdigitalPCRwerecompared.ResultsThemethodofchosenaftercomparingtheresultsofthethreedetectionlowerlimitcalculationmethods.ConclusionDigitalPCRisasen鄄sitiveandaccuratemethodfordetectinggenemutations.Thelowerlimitofdetectioncanbequantifiedusingpoissondistri鄄biopsy.microdropletdigitalPCRforKRASmutationdetectionwassuccessfullyestablished.Aconservativecentralalgorithmwasbutionalgorithmbasedonfalsepositiverate,andthecomprehensivedetectionperformanceissuitableforclinicalliquid[Keywords]KRAS;MicrodropletdigitalPCR;Lowerlimitofdetection数字PCR概念遥2011年数字PCR仪器问世袁但是国内鲜有对数字PCR液态活检灵敏度的量化评价研究[2-4]遥1999年B.Vogelstein[1]在检测KRAS突变时提出了21世纪初袁美国临床和实验室标准院发表了EP-标准化组织也颁布了论述LOD的文件要ISO11843遥但业界缺乏对于LOD重要性的认知导致的袁现有的标准也忽略了现代仪器的特点而且往往只适用于正态分布[5]遥滴式数字PCR渊DropletDigitalPCR袁ddPCR冤系统量化评价了数字PCR对cfDNA中肠癌相关KRAS突变检测的灵敏度袁并比较了计算方式间差异遥为数字PCR标准化提供了方法依据袁为数字PCR应用于肿瘤液态活检提供了理论依据遥1材料与方法1.1标准品质粒标准品由实验室构建并克隆袁选择KRAS基该研究于2017年1月基于Bio-Rad公司的QX200微17A文件要确定检测下限渊LimitofDetection袁LOD冤与定量下限渊LimitofQuantification袁LOQ冤的方法遥同时袁国际[作者简介]罗宇文渊1987-冤袁男袁上海人袁在读硕士袁研究方向院分子诊断遥[通讯作者]李瑶渊1965-冤袁女袁重庆人袁博士袁教授袁研究方向院肿瘤功能基因组研究尧基因表达调控研究尧非编码RNA的作用及机制研究袁E-mail院yaoli@fudan.edu.cn遥18中外医疗China&ForeignMedicalTreatment因12和13号外显子上7个突变型和野生型基因作为备选基因袁突变型包括院G12C尧G12V尧G12D尧G12R尧G12S尧G12A尧G13D遥1.2样品处理于郑州大学附属医院20名平均年龄45遥岁健康人对照血浆标本均来自血浆按照临床常规方法采集血液袁在采集分离当天提取cfDNA遥1.3微滴式数字PCR方法建立扩增子为ddPCR7种常见引物探针设计原理为KRAS突变基因型与野生型TAQ-MAN探针法KRAS袁遥所有突变型和野生型使用通用上下游引物并分别针对每种突变型设计FAM标记的Taqman探针袁同时对于KRAS与HEX野生型设计的拷贝数读值比例体现突变基因含量HEX标记的Taqman探针袁遥以每个反FAM应体系中加入2滋L反应模板遥将每个配制好的PCR反应体系通过QX200?Droplet并于普通Generator(Bio-Rad)PCR仪上进行扩增制备为遥PCR20反应结束后将000个反应微滴96孔板放入QX200TMFAM和HEX的荧光信号DropletReader遥仪器会自动分析每个样品的(Bio-Rad)中同时检测每个微滴中荧光信号袁获得靶序列在PCR反应体系中的拷贝数浓度(单位院copies/滋L)及突变浓度遥1.4方法学论证1.4.1质粒标准品分别使用检测性能分析通过梯度混合不同比例的突变型ddPCR进行3重复检测袁并同时检测野生型质粒标准品与空白对照袁所有标准品质粒在反应体系中的终浓度为1伊105拷贝遥以野生型质粒及空白对照检测结果的假阳性程度判定检测方法的特异性袁以梯度混合突变型质粒的稳定检出范围渊变异系数CV臆25%尧依次G12C为院100%和决定系数G12D尧10%基因型梯度混合突变型质粒的梯度R2逸0.98冤定义LOQ遥尧1%尧0.1%尧0.01%曰G12V尧G12R尧G12S尧G12A尧G13D依次为院1%尧0.2%尧0.1%尧0.04%尧0.01%遥基因型梯度混合突变型质粒的梯度1.4.2方式来讨论LOD计算ddPCR如果以的LOD袁ISO则默认其检测结果服从正11843及EP-17A的分析态分布袁由于在抽样量足够大的情况下袁泊松分布的极限是正态分布袁所以该研究中尝试了正态分布相关的LODLOB=滋算法院LOD=LOB+1.645滓b+1.645滓bs其中滋b为阴性对照测得均值袁滓b为阴性对照测得标准差袁滓s为低浓度阳性样本测得标准差袁LOB为空白本底检测限渊LimitofBlank冤遥对于ddPCR更为科学的方式是通过泊松分布的置信区间计算LOD遥首先LOB需要通过假阳性率渊False2018NO.27China&ForeignMedicalTreatment中外医疗Positive反应中出现的假阳性微滴数Rate袁FPR冤计算袁这里的袁计算公式为FPR定义为平均每个院FPR=fa1se以FPR的泊松分布正向positivedropletsnumber/wells遥95%置信区间分位数作为LOB袁位数来推测同时以LODLOB的数学期望作为LOD的负方向遥其估计方法最常见为查95%置信区间分阅泊松分布概率密度函数表袁在Milbury等的研究中则采用了泊松分布样本量较大时的正态分布近似计算法[6]如表1所示遥表1泊松分布的正态近似LOD计算方法FPR0LOB0~0.050LOD>0.05LOB=FPR+1.64513姨FPRLOD=渊1.645+姨51.6452+4LOB冤2/42结果2.1ddPCR检测线性图1所示为G12C与G12D的理论/测得值线性图袁图2所示为G12V尧G12R尧G12S尧G12A尧G13D的理论/测得值线性图遥所有突变型各样品都检出阳性袁0.1%及以上浓度的CV都小于25%遥野生型质粒和空白对照检测结果都没有出现假阳性袁所有突变基因型线性方程的R2都大于0.98遥图1G12C与G12D线性图袁横轴为理论值袁纵轴为测得值图2G12V尧G12R尧G12S尧G12A尧G13D的线性图袁横轴为理论值袁纵轴为测得值2.2健康人样本的ddPCR检测及LOD值该研究中比较了3种ddPCR理论LOD值判定法院第1种是依据正态分布计算LOD(LOD判定法1)袁其低China&ForeignMedicalTreatment中外医疗19中外医疗China&ForeignMedicalTreatment表2LODLOD1(copies/well)G12C1.3053G12S1.40533种不同方法判定的ddPCRKRAS突变检测法的LODG12R2.1463G12V2.1163G12D1.7263G12A1.7163G13D1.73632018NO.27LOD2(droplets/well)LOD3(droplets/well)注院LOD1对应LOD判定法1曰LOD2对应LOD判定法2曰LOD3对应LOD判定法3遥3种LOD值都与对应LOB具有显著差异袁P约0.05遥浓度样本误差来自0.01%及0.04%质粒标准品的ddPCR检测数据遥第2及第3种都依据于ddPCR中阳确立的LOD算法有足够的统计学依据与实验证据支持袁可以推广到多种基于数字PCR检测实验的灵敏度判定中遥同时袁该研究中基于临床样本判定的LOD可以使用大量临床样本进行验证袁并结合患者确诊情况和用药情况建立ROC曲线尧确定科学的CutOff值袁为临床应用奠定基础遥[1]VogelsteinB,KWKinzler.DigitalPCR[J].ProcNatlAcad[2]HudecovaI.DigitalPCRanalysisofcirculatingnucleicacid[3]LaurentpuigP,PekinD,NormandC,etal.ClinicalRelevanceofKRAS-MutatedSubclonesDetectedwithPicodropletDigitalPCRinAdvancedColorectalCancerTreatedwithAnti-EGFRTherapy[J].ClinicalCancerResearchAnOfficial2015,21(5):1087-1097.s[J].ClinicalBiochemistry,2015,48(15):948-956.SciUSA,1999,96(16):9236-9241.性微滴符合泊松分布袁区别是LOD判定法2采用表1中的计算法袁而判定法3采用了查表法遥具体判定结果见表2遥3讨论在肿瘤突变基因的液态活检中袁cfDNA由于含量极低所以对于检测方法的灵敏度及低浓度下定量精确度有较高要求遥数字PCR应用于肿瘤突变基因液态活检研究大多都还在使用标准品实验经验值判定灵敏度而分布的数学模型进行LOD尧LOQ分析的意义重大遥国外已有报道袁其定量检测数据优于qPCR[7-8]遥但同类没有使用量化的临床判定标准袁所以该研究基于泊松ddPCR的LOD对应反应中拷贝数总量为3.48[参考文献]拷贝袁由于目前所使用ddPCR设备的总微滴数上限为确定量可达到20000拷贝袁故其灵敏度可以达到度则一般为0.1%左右遥20000个袁对应可测得拷贝数上限为100000拷贝袁精0.017%~0.003%遥而同类qPCR或ARMS-PCR的灵敏以该次实验结果可判断袁微滴式数字PCR具有超过现有常见PCR方法的灵敏度和定量精准度袁其LOD可以以泊松分布量化计算遥同时袁该研究中LOD判定法3在临床血浆cfDNA液态活检应用中袁数字PCR测得综上所述袁数字PCR适合用与液态活检等高灵敏度需求的应用遥综上所述袁该研究量化评估了数字PCR在对于血浆cfDNA中KRAS突变检测实验中的灵敏度袁研究中值可以与中国人理论突变水平对应袁验证了其可靠性遥JournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch,[4]钱坤袁张毅.组织样本保存状态及时间对EGFR基因突变检测结果的影响[J].临床肿瘤学杂志,2014,19(2):132-135.科学技术文献出版社,2007:119-123.[5]冯仁丰.临床检验质量管理技术基础[M].2版.上海:上海[6]Milbury,C.A.DetermininglowerlimitsofdetectionofdigitalularDetectionandQuantification,2014,1(1):8-22.中国生物工程杂志,2017,37(6):93-96.PCRassaysforcancer-relatedgenemutations[J].Biomolec[7]赵治国,崔强,赵林立,等.微滴数字PCR技术应用进展[J].[8]Abbosh,C.PhylogeneticctDNAanalysisdepictsearly-stagelungcancerevolution[J].Nature,2017,545(7655):446-451.渊收稿日期院2018-06-28冤文题文题应以最恰当尧最简明的词语反映论文最重要的特定内容遥一般使用能充分反映论文主题内容的短语袁不使用具有主尧谓尧宾结构的完整语句袁一般不使用标点和缩略语遥中文文题一般不宜超过20个汉字遥尽可能不设副题袁确有必要时袁可采用不同字体字号或加破折号将副题与正题加以区分遥20中外医疗China&ForeignMedicalTreatment
