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红景天对大鼠脑缺血再灌注c-Fos表达及神经细胞凋亡的影响

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中国康复理论与实践2014年3月第20卷第3期Chin J Rehabil Theory Pract,Mar.2013,Vo1.20,No.3 ——233—— DOI:i0.3969/j.issn.1006・9771.2014.03.009 ・基础研究・ 红景天对大鼠脑缺血再灌注c.Fos表达及神经细胞凋亡的影响 陈江君,刘宁, 【摘要J 目的探讨红景天对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中c—Fos表达水平及神经细胞凋亡的影响。方法Wistar大鼠120只, 分为假手术组、模型组和干预组(红景天),各组再分为3 h、6 h、12 h、24 h、48 h共5个亚组,每个亚组8只大鼠。后两组采用大 脑中动脉线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型,干预组术前红景天每天0.672 eCkg灌胃15 d。参考Longa法在大鼠麻醉清醒后进行 评分,应用免疫组化、TUNEL法检测各组c—Fos表达及神经细胞凋亡。结果分下降(P<O.05)。结论模型组和干预组缺血脑组织中c.Fos表达明显增加 (尸<0.01),于再灌注48 h达高峰;与模型组相比,干预组c—Fos表达减少(P<0.05),神经元凋亡明显减少(P<0.O1),神经功能缺损评 红景天能抑制大鼠脑缺血再灌注后脑组织中c.Fos表达,减少神经元凋亡,减轻缺血再灌注损伤。 I关键词l红景天;缺血再灌注;c.Fos;神经元;凋亡 Effects of Rhodiola on Expression of c-Fos and Neuronal Apoptosis after Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury in Rats CHEN Ji— ang-jun,LIUNing,CHENJun.Department ofNeurology,First Hospital ofLanzhou University,Lanzhou 730000,Gansu China Abstract:Objective To investigate the effect of Rhodiola Rosae P E on the expression of c—Fos and the apoptosis of neuronal in rat brain after ischemia/reperfusion(I/R)injury.Methods 1 20 Wistar rats were divided into sham group,model group and intervention group, subgrouped as 3 h,6 h,1 2 h,24 h,and 48 h.The model and intervention groups underwent middle cerebral artery occlusion,and the latter accepted Rhodiola 0.672 g/kg daily for 1 5 d.They were assessed with Longa’S score.The expression of c—Fos and apoptosis of neuronal were measured with immunohistochemistry nd TUNEL.Results The expression of ac—Fos in the ischemic area increased after cerebral isch— emia/reperfusion(P<0.01),peaking at 24 h after injury,and decreased in the intervention group(尸<0.01),with the decrease ofneuron印op— tosis and Longa’S score fP<0.01).Conclusion Rhodiola protects the brain tissue against ischemia/reperfusion injury by inhibiting the expres- sion of c・Fos and apoptosis in rats. Key words:Rhodiola;ischemia/reperfusion;c—Fos;neuron;apoptosis 【中图分类号J R743.3 l文献标识码l A l文章编号l 1006—9771(2014)03-0233—03 I本文著录格式l陈江君,刘宁,.红景天对大鼠脑缺血再灌注c.Fos表达及神经细胞凋亡的影响[J].中国康复理论与实 践,2014,20(3):233—235. 缺血性脑血管病是神经系统常见病、多发病,死 亡率、致残率高,严重影响人民群众的生命安全及生 活质量u 。脑缺血后恢复脑血流是治疗脑缺血最关键 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物3~4月龄健康雄性Wistar大鼠120 的方法,但再灌注后可加重缺血脑组织的损伤。这种 损伤以凋亡为主,减少缺血再灌注后神经元凋亡为重 要的脑保护机制。 c—Fos与细胞凋亡的关系争议较多 。 。实验研究 只,体重220~250 g,由兰州大学动物实验中心提供。 1.1.2试剂 红景天:诺迪康药业股份有限公司, 批号:Z10980020。c—Fos单克隆抗体、SABC免疫组 化试剂盒、DAB显色试剂盒、多聚赖氨酸及凋亡检 测试剂盒:南京中杉生物工程有限公司。 1.2方法 显示,长期应用红景天(Rhodiola Rosae P目对脑缺血 再灌注具有一定的保护作用。本研究拟从蛋白水平观 察大鼠缺血再灌注后海马组织c—Fos表达水平与神经 细胞凋亡关系,并阐释红景天脑保护作用的部分机 制 1.2.1动物分组大鼠分为假手术组、模型组和干预 组,各组再分为3 h、6 h、12 h、24 h和48 h共5个亚 组,每个亚组8只。干预组术前予红景天每天0.672 g/ 灌胃15 d,假手术组、模型组每天予等量生理盐水 基金项目:甘肃省自然科学基金项目(No.1107R3YA072)。 作者单位:兰州大学第一医院神经内科,甘肃兰州市730000。作者简介:陈江君(1978一),男,汉族,甘肃兰州市人,主治医师,主要从事神 经内科脑血管病工作。 http://www.cjrtp0nline.corn —-234—— 中国康复理论与实践2014年3月第2O卷第3期Chin J Rehabil Theory Praet,Mar.2013,Vo1.20,No.3 灌胃15 d。 ANOVA),方差齐用Bonferroni检验,方差不齐用 1.2.2动物模型制备1.3行为学评分 根据Longa 的改良线栓法制备 Tamhane f检验。显著性水平a=0.05。 2结果 大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)2 h后再灌注模型。 参考Longa的5分法在大鼠麻醉清醒后进行评 2.1行为学评分 分。0分:无神经损伤症状。1分:不能完全伸展对侧 前爪。2分:向对侧转圈。3分:向对侧倾倒。4分: 不能自发行走,意识丧失。 1.4 c—Fos免疫组化染色 大鼠清醒后均出现轻重不等的神经功能缺损症 状;与模型组比较,干预组于术后各时间点均明显降 低 0.01)。见表1。 2.2 c.Fos免疫组化染色 假手术组见极少量阳性细胞;模型组再灌注3 h 脑组织海马CA1区c—Fos阳性细胞数增加,48 h达高 峰,72 h仍有表达(P<0.01)。干预组c—Fos阳性细胞数 在缺血后各时间点均较模型组明显减少(P<0.01)。见 表2。 采用SABC法,参照免疫组化试剂盒说明书操 作。c.Fos蛋白阳性细胞为胞浆和胞核着色呈棕黄 色。每张切片选择缺血灶周围6个不连续的高倍视野 (400 ̄),计数阳性细胞数,取平均值。 1.5 TUNEL法检测 石蜡包埋大鼠脑组织块,海马平面连续冠状切 2.3神经元凋亡数 假手术组海马CA1区有少量凋亡细胞。模型组再 灌注3 h后,CA1区凋亡细胞数明显增多,48 h最多 (尸<O.01)。干预组细胞凋亡数明显减少(尸_<0.01)。见表 3 片,厚4 p.m。试剂盒染色,光镜观察凋亡细胞数。 1.6统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行处理。结果用 ± 表示。各组比较采用单因素方差分析方法(Oneway. 表1各组行为学评分比较 注:a:与假手术组比较,P<0.01;b:与模型组比较。P<0.01 3讨论 内外学者共同关心的课题。脑组织海马CA1区对脑缺 脑血管病是人类死亡的三大杀手之一,其中70% 为脑梗死。寻找对脑梗死有效的治疗途径,是目前国 血最为敏感,即使短暂的脑缺血也可造成延迟性神经 元死亡(DND),DND主要机制为细胞凋亡。 中国康复理论与实践2014年3月第2O卷第3期Chin J Rehabil Theory Pract,Mar.2013,Vo1.20,No.3 ——235—— 细胞凋亡是缺血后脑细胞丢失的一种形式。凋亡 调节基因如bcl一2、bax可能在脑细胞凋亡过程中起重 稳定动脉粥样硬化斑块的作用。本研究结果显示,大 鼠脑组织缺血再灌注3 h后,C-Fos蛋白表达增加,同 时CA1区凋亡神经元数量增加。提示c-Fos在神经元 中的出现是凋亡发生的信号。 [参考文献] [1]蔡紫峰,杨卓.脑缺血损伤的研究进展[J].继续医学教育, 2004,18(4):53—55. 要作用;此外,兴奋性氨基酸如谷氨酸、Ca 、自由 基、血小板凝集因子(PAF)等亦参与凋亡过程 】。 Chandrasekar等注意到,在缺血过程中,c—fos、c-jun 等基因较早表达 ;c fos、c-jun家族基因产物通过亮 氨酸拉链形成可结合至核因子.r,BfNF.r_B)、激活蛋白一 1(AP.1 等转录因子位点的异二聚体,从而选择性 迟发性基因的表达。 [2]Koennecke HC.Editorial comment-challenging the concept of adynamic penumbra in acute ischemic stroke[J].Stroke, 2003,34(1 o):24-34. [3】Nagasawa H,Kogure K.Correlation between cerebral blood lfow and histologic changes in a new rat model of middle cere. c.1os原癌基因研究始于20世纪80年代中后期, 因与小鼠成骨肉瘤中致癌基因v—los同源,故称为c— los原癌基因 ],它属于即刻早期基因。一般情况下, c—los基因在许多组织低水平表达,可能与DNA损伤 及修复相关,具有神经保护作用,与细胞的生长、繁 bral artery occlusion[J].S ̄oke,1989,2O(8):1037—1043. [4]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et a1.Reversible middle cerebral a ̄ery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20(1):84—91. [5]Espinoza MI,Parer JT.Mechanisms of asphyxial brain dam— 殖、分化、信息传递、学习和记忆等众多生理功能有 关;当受到外界如缺血、缺氧等刺激时,表达水平会 有显著改变 ,可出现过度表达,其产物Fos蛋白由胞 质转入核内,与c—jun基因的产物Jun蛋白形成Fos— Jun异源二聚体,作用于DNA的特殊序列,调节相关 基因转录,发挥第三信使的作用,进而干预细胞核的 修复,导致细胞凋亡[91。也有研究表明,c。fos基因的 表达能抑制脑缺血后神经元死亡或凋亡的程度,c.fos 基因表达越高,相应的脑组织损伤越轻n 。 age,and possible pharmacologic interventions,in the fetus[J]. Am J Obstet Oynecol,2005,1 641:6):1 582-1 589. [6]Chandrasekar B,Mummidi S,Mahimainathan L,et a1.Interleu— kin--1 8・・induced human coronary artery smooth muscle cell mi—・ gration is dependent on c-fos and AP-1一mediated matrix metal— loproteinase一9 expression and is inhibited by atorvastatin[J].J Biol Chem,2006,281(22):15099—15109. 【7]Morgan J1,Curran T.Stimulusrtnsacription coupling in het ner- VOUS system:involvement of the inducible protooncogenes fos 红景天主要成分有红景天苷、多种黄酮和人体必 需的18种氨基酸、多种微量元素。它通过黄酮类化合 物对血管壁的软化作用,以及血液流变学的改变实现 ndjun[aJ]_Ann RevNeurosci,1991,14:421—451. 【8]Rau SW,Dubal DB,B6ttner M,et a1.Esrtadiol diferentially 对脑血管的保护作用;其中黄酮及红景天苷能祛除血 液中过多的脂质成分和沉积在血管上的脂质,对过氧 regulates C—Fos after focal cerebral ischemia[J].J Neurosci, 2003,23(33):10487—10494. [9]Schbitz WR,Schade H,Heiland S,et a1.Neuroprotection by hy— perbaric oxygenation after experimental focal cerebral isch- 化脂质生成有明显抑制作用,具有抑制血小板聚集, 抗氧化应激及改善微循环等作用。以往的研究显示, 红景天可能通过多种途径,保护缺血脑组织、挽救缺 血半暗带,具有神经保护作用。 他汀类药物能通过调节c.Fos等炎症介质的活 性,减轻动脉粥样硬化病变中的炎症反应,从而发挥 emia monitored by MRJ[J].Stroke,2004,35(5):1 1 75—1 1 79. [10]Whitifeld J,Neame SJ,Paquet L,et a1.Dominant・neg ̄ive C— Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrcmec release[J].Neuron, 2001,29(3):629-643. (收稿日期:2013—07.15 修回日期:2013.09.11) http://www.cjrtponline.corn 

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