降低S100A6基因表达对胃癌细胞生物学特性影响的研究

・２２０・　ＭＯＤＥＲＮ　ＯＮＣＯＬＯＧＹＦｅｂ．２０ｌＯ．Ｖ０Ｉ．１８．Ｎ０．２　．降低Ｓ１００Ａ６基因表达对胃癌细胞生物学特性影响的研究　张林　，黄海力　，王孟薇　，吴本俨　，吴凯　Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｔｉｓｃｓ　ａｆｔｅｒ　ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　Ｓ１００Ａ６　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌＩＩｉｎｅｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｌｉｎ　，ＨＵＡＮＧ　Ｈａｉ—ｌｉ。ＷＡＮＧ　Ｍｅｎ—ｗｅｉ　．ＷＵ　Ｂｅｎ—ｖａｎ　。ＷＵ　Ｋａｉ　，‘Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｆＧｅｏｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｆＰ　，ｏＢｅｉｊｉｎｇ　１０００９１，Ｃｈｉｎａ；　Ｄｅｐａｒｔｅｎｔｍ　ｆＧｏｅｒａ—　ｔｏｌｏｇｏｕｓ　Ｇａｓｔｒｏｅｔｅｒｎｏｌｏｇｙ，ｅｎＧｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＰＬＡ，ＢｅＵｉｎｇ　１００８５３，Ｃｈｉｎａ．　【Ａｂｓｔｒａｃｔ１　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓ１００Ａ６　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｅｐａｔｏｓｉｓ，ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅＵ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆｔｈｅ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃＲｎｃｅｒ　ｌｉｎｅ　ＳＧＣ７９０１．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｓ　ａ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆＳ１００　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｉｌｅｎｇｃｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔｏ　Ｓ１００Ａ６　ｗａｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ，ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓ１００Ａ６　ｍＲＮＡ．Ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｏｆ　ＩＭＧ８００　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｕ６　ｐｍｍｏ￣ｒ．Ｔｈｅ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘ－　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｐｅｃｉｆｃ　ｔｏ　Ｓ１００Ａ６　ｇｏｎｅ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｕｃｔｒｅｄ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ＳＧＣ７９０１　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ．　Ｔｈｅｎ　ｓｔａｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｐｐｒａｉｓｅｄ．Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｃｙ－　ｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｍａｋｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅｓ　ａｎｄ　ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｒｅｓｐｅｃ—　ｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｉｌｒａｔｉｔｏｎ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｓｔａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｈｏｓｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ１００Ａ６　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　７５％ｉｎ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ｏｒ　８５％ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ　ａｐｐｒａｉｓｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＲＴ—ＰｅＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｎ—ｂｌｏｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ．　ｈｅ　ｓｔａｂｌＴｅ　ＲＮＡｉ　ｆｏｒ　Ｓ１００Ａ６　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｇｒｏｗ　ｓｌｏｗｅｒ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｔｈａｎ　ＳＧＣ７９０１　ａｎｄ　ＳＧＣ—ＩＭＧ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｆｉｔｈ，ｓｉｘｔｈ　ａｎｄ　ｓｅｖｅｎｔｈ　ｄａｙｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｅｅｎｔｒ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｌｅ　ＲＮＡｉ　ｆｏｒ　Ｓ１００Ａ６　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ　ｓｌｏｗｅｒ，ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｇｏ—Ｇｌ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｇ２一Ｍ　ａｎｄ　Ｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｗｅｒ　ｓｉｎｉｇｉｆｃａｎｔｌｙ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｈｅｒｇ　ｈａｎ　ｔｈａｔｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｃｏｌｏｎｙ　ｏｆｒｍａ－　ｉｔｏｎ　ａｓｓａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆＳ１００Ａ６　ＲＮＡｉ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜　０．０５）．Ｆｕｒｔｈｅｒ　ｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡｉ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗａｓ　ｍｕｃｈ　ｌｏｗｅｒ　ｈｔｎ　ａｈａｔｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ　＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｓ１００Ａ６　ａｌｓｏ　ｃａｎ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｈｅ　ｔｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｎｄ　ａｒｅｓｒｔｉａｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｉｔ　ｃａｎ　ｈｅｌｐ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｉｎｆｉｌｒａｔｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｔ￣ｔａｓｉｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｃｅｌｌｓ．Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　Ｓ１００Ａ６　ｉｎ　ｇａｓｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｒｌ　ｌｉｎｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ｇｓｔａｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ；Ｓ１００Ａ６　ｇｅｎｅ；ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ；ＲＮＡｉ　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　２０１０，１８（０２）：９２２０—０２２５　【摘要】　目的：初步探讨Ｓ１００Ａ６基因对于胃癌细胞生长、增殖状态，细胞周期，凋亡状态等生物学特性及成　瘤、浸润转移能力等恶性表型的影响。方法：Ｓ１００Ａ６基因的ＲＮＡｉ载体通过脂质体介导法转染Ｓ１００Ａ６基因　高表达ＳＧＣ７９０１细胞，后经Ｇ４１８压力筛选法获得稳定转染的细胞系，经过ＲＴ—ＰｅＲ法、免疫细胞化学法及　Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｉｎｇ法证实。对稳定表达株进行鉴定，而后使用流式细胞仪、生长曲线法、平板克隆形成实验法、　细胞迁徙实验等方法分析稳定表达株相关生物学特性与恶性表型的变化，每种检测实验均设立ＲＮＡｉ载体稳　定转染细胞组、ＩＭＧＳ００空载体稳定转染细胞组和空白ＳＧＣ７９０１细胞组。结果：稳定的Ｓ１００Ａ６基因ＲＮＡｉ细　胞系经过ＲＴ—ＰＣＲ法、免疫细胞化学法及Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｉｎｇ法证实，ｍＲＮＡ抑制率可达７５％左右，蛋白产物的　抑制率达８５％左右。与转染ＩＭＧＳ００空载体及空白ＳＧＣ７９０１胃癌细胞相比转染Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡｉ载体的稳定表　达细胞株生长减慢，各时间点细胞计数显著低于对照组（Ｐ＜０．０５）；后两组之间亦无显著差异，细胞周期检测　显示Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰组Ｇｏ—Ｇ。期比例显著高于对照组，而Ｇ：一Ｍ及ｓ期比例显著低于对照组（Ｐ＜０．５），０　）９—０４—２２　【收稿日期】　２ｏ（ｏ７一ｏ７　【修回日期】　一【基金项目】　国家自然科学基金资助项目（编号：３０６００７２８）　【作者单位】　解放军总医院第二附属医院消化科，北京１０００９１　解放军总医院老年消化科，北京ｙａｈｏｏ．ｏｏｎ１．ｃｎ　１００８５３　９７６一），男，山西太原人，医学博士，主治医师，主要从事消化道肿瘤分子生物学研究工作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｄａｈａｎｍｉｎｕｔ２０００＠　【作者简介】　张林（１２０１０年２月第１８卷第２　・２２１・　其它各期细胞比例均无显著差异。平板克隆形成实验结果显示Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰组克隆形成率显著低于对　照组（Ｐ＜Ｏ．０５）；，细胞迁徙实验结果提示￥１００Ａ６　ＲＮＡ干扰组穿膜率显著低于对照组（Ｐ＜０．０５）。结论：　Ｓ１００Ａ６基因可能具有促进细胞生长增殖作用，同时可影响细胞周期，增加处于分裂期细胞的比例可能具有促　进细胞分裂作用，并可促进胃癌细胞侵袭转移。降低Ｓ１００Ａ６基因表达可能抑制胃癌细胞的恶性生物学行　为。　【关键词】胃癌；Ｓ１００Ａ６基因；细胞周期；ＲＮＡ干扰　【中图分类号】Ｒ７３０；Ｒ７３５．２【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７２－４９９２一（２０１０）０２—０２２０—０６　Ｓ１００Ａ６基因是Ｓ１００家族成员之一，该家族是具有ＥＦ一　手型模体结构的ｃａ　结合蛋白诸多分子家族中的最大一个　的ＤＮＡ双链序列：　ＤＮＡ片段１（Ｓｉｌ）：　亚家族。目前已发现的Ｓ１００蛋白家族有２Ｏ多个成员，这些　成员的功能也多种多样，目前较为认同的是它们通过与　ｃａ　结合，广泛参与了细胞的生长、运动、细胞周期调节、基　因转录以及细胞分化等过程。Ｆｅｒｒａｒｉ等　于１９８７年取得了　Ｓ１００Ａ６基因的ｃＤＮＡ全长，证实该基因由３个外显子组成，　编码由９０个氨基酸残基组成的小分子蛋白质。染色体定位　为ｌｑ２１。近来的一些研究表明Ｓ１００Ａ６基因表达的蛋白分子　在许多人类肿瘤中表达上调，可能影响着细胞的各项重要生　物学功能，影响胞内某些癌基因或抑癌基因水平进而一定程　度上影响细胞的部分生物学性状，对肿瘤细胞恶性表型的维　持具有重要意义。以往　使用ｃＤＮＡ基因芯片检测胃腺癌　与癌旁正常粘膜组织的差异表达基因，发现癌组织中　Ｓ１００Ａ６基因表达水平显著高于正常组织，但国内外目前尚　无该基因在胃癌细胞中功能意义的研究报道。本研究以　ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）的方法将针对Ｓ１００Ａ６基因的真核细胞　ＲＮＡｉ载体导入胃腺癌细胞株ＳＧＣ７９０１中，并筛选出稳定表　达细胞株，而后检测该细胞株相关生物学性状的变化，初步　分析该基因在胃癌中的功能意义及降低其表达对恶性生物　学性状的影响。　１材料与方法　１．１材料　胃腺癌细胞系ＳＧＣ７９０１来源于上海生物技术研究所，为　解放军总医院老年消化病实验室保存。Ｓ１００Ａ６单克隆抗体　购自美国ＣＢＩ公司，ＩＭＧＳ００载体为本室保存，普通细胞培养　板购自比利时Ｏｒａｎｇｅ公司，ＴｒａｎｓｗｅＨ细胞培养板购自美国　Ｃｏｓｔａｒ公司，Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶购自美国ＢＤ公司。ＡｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ　凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。本研究　中所用各种引物均由上海博亚生物技术公司合成。　１．２方法　１．２．１　胃腺癌细胞株ＳＧＣ７９０１中Ｓ１０ｏＡ＿６基因表达情况的　检测　使用ＲＴ—ＲＣＲ法和免疫细胞化学法检测细胞内　Ｓ１００Ａ６的表达，显示该细胞株为Ｓ１００Ａ６的高表达细胞株，　适于转染实验研究。　１．２．２　Ｓ１００Ａ６基因ＲＮＡ干扰载体的构建从ＧｅｎＢａｎｋ中　检索到Ｓ１００Ａ６　ｃＤＮＡ序列，选择其开放阅读框架（ＯＲＦ），按　照ＲＮＡｉ设计原则以ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ软件辅助设计选择两段片　段为ＲＮＡ干扰片段。　选择序列：　１：ａａｇｇａｇｃｔｃａｃｃａｔｔｇｇｃｔｃｇｌ　１．２．３　ＲＮＡ干扰连接载体用ＤＮＡ片段的设计与合成　对　上述两序列进行加茎环与其反向重复序列相连，３　端再加入　５连ｔ尾，再选择其互补序列加茎环与反向重复序列相连，两　链５　端分别加入）【ｂａＩ与ＳｃａＩ酶切位点，形成两对连接载体　３￣ｃｃｔｃｇａｇｔｇｇｔａａｃｃｇａｇｃｃｔｃ　ＤＮＡ片段２（Ｓｉ２）：　同时设置两条负链点突变对照。　ＤＮＡ片段３（Ｓｉ３）：　ｔｔｔｔｔ　３　ＤＮＡ片段４（Ｓｉ４）　５　３　３　ｔｃ　５　（黑色下划线碱基为突变碱基）　设计完成后序列送上海博亚生物技术公司合成。　１．２．４　Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰载体构建按照常规分子克隆方　法通过ＤＮＡ单链退火，片段与ＩＭＧ８００的ＸｂａＩ、Ｓａｉｌ载体双　酶切，连接反应，连接产物的转化，扩增后测序获得Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰载体。　１．２．５　Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰载体转染胃癌ＳＧＣ７９０１细胞首　先采用北京天为时代高纯度质粒中提试剂盒提取序列完全　正确的Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰载体及点突变载体和ＩＭＧＳ００空载　体，详细步骤见试剂盒说明，然后采用美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司Ｌｉ－　ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００脂质体转染试剂盒进行转染反应，操作按　说明书进行。　１．２．６有限稀释法和Ｇ４１８压力筛选法筛选稳定转染的细　胞株将上一步转染的细胞用胰酶消化后做细胞计数，按每　孔５Ｏ个细胞移至９６孔细胞培养板中，每孔按５００￣ｇ／ｍｌ加　入Ｇ４１８继续培养。培养４周后挑取稳定生长的细胞克隆，　并将其逐次移至２４孔，６孔板及培养瓶中扩大培养，然后留　细胞种冻存于一８０℃。　１．２．７稳定转染细胞系的鉴定Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰稳定转　染细胞系的鉴定方法采用免疫细胞化学法、ＲＴ—ＰＣＲ法和　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｉｎｇ法。计算干扰效率时使用ＢａｎｄＳｃａｎ软件计算　每条带灰度值，并按照如下公式计算干扰效率：　基因转录或蛋白表达抑制率＝　干扰后Ｓ１００Ａ６灰度值／干扰后内标灰度值　对照Ｓ１００Ａ６灰度值／对照内标灰度植　１．２．８　细胞生长曲线法检测稳定表达Ｓ１００Ａ６细胞及　Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰稳定转染细胞生长状况　取对数生长期　的稳定转染细胞株一瓶，Ｓ１００Ａ６　ＲＮＡ干扰稳定转染细胞以　点突变转染组、ＩＭＧＳ００载体转染组和ＳＧＣ７９０１空白细胞为　对照。胰酶消化后以完全培养基制成细胞悬液，以每孔５×　１０　／ｍｌ的浓度接种于２４孔培养板中。每：ｆＬａｉｌ入ｌｍｌ含２％　󰀀222󰀀MODERNONCOLOGY．Feb2010．，VOI18．，NO2．胎牛血清的维持培养基培养全消化后计数以，一周每日取，5孔细胞胰酶完，检测结果均为阳性表明未处理的，SGC7901细胞中5孔平均值绘制细胞生长曲线。S100A6基因高表达S100A6RNAi。经稳定转染及G418压力筛选后获得SZl21、129．．流式细胞仪检测细胞周期一取对数生长期的稳定转空白细胞为对照载体稳定转染细胞系SZ31SZA5、SZ23。，点突变对照染细胞株染组、瓶，S100A6RNA干扰稳定转染细胞以点突变转SGC790124。载体稳定转染细胞系，(见图)IMGS00载体转染组和将800细胞培养基换成无血清培养基培养小时(短期饥饿法同。步化)再换为完全培养基培养，24小时一胰酶消化后，转／分离心以，pHm为8，．0的PBS清洗次再离心后碘化丙，啶(PI)染色10in然后上流式细胞仪检测细胞周期重复实。验．3．次取平均值进行比较，1210AnexinV、PI双染法检测细胞凋亡情况的变化一取对数生长期的稳定转染细胞株瓶，S100A6RNA干扰稳定SGC790124。转染细胞以点突变转染组空白细胞为对照。、IMG800载体转染组和将细胞培养基换成无血清培养基培养，小时(短期饥饿法同步化)再换为完全培养基培养胰酶消化后80024小时一转／分离心以pH为，8．0in的，PBS清洗10次in，再离心后依次12．AnexinV—FITC染色。30mPI染色m后22．图1未处理SGC790—1细胞es中可见nS100A6阳性(SP×200)上流式细胞仪检测细胞凋亡情况．用RTPCR法W、tebloting法及免疫细胞化学法SGC790111平板克隆形成实验500培养至对数生长期的各组细60mm检测稳定转染$100S100A6A6RNAi载体的细胞中胞分别计数后按每板皿个细胞接种至，的细胞培养50基因表达情况$100A6RNAi中。常规培养。3周后吉姆萨染色镜下计数细胞数多于／500结果显示载体稳定转染细胞与点突变对空载体的SGC7901细胞。个的克隆数12．．按照：克隆~ll计算克隆形成率。照稳定转染细胞系和转染IMG80012Transwe穿膜实验检测细胞侵袭力变化nswe方法：Ma，—进行相比较胞膜(见图3，S100A6基因表达已显著降低(见图2)免疫细利用trCASTOR公司的Trall。实验系统配合BD”0公司的胞化学结果显示)。$100A6基因细胞内表达主要分布于胞浆和igel生物胶按说明进行操作，参照贺慧颖等的方法每组设置3个副孔培养24小时后以胰酶消化膜两侧的细胞IhIGSZl2SZ23SZ3lSZ45分别计数12．．。按膜内侧细胞数／总细胞数计算穿膜率。13PCNA增殖指数检测将筛选出的稳定表达细胞，L板中制作细胞爬片种植人铺有挂胶盖玻片的六孑。然后按。照常规免疫细胞化学方法检测细胞中PCNA的表达情况染色后每组随机选取，10个视野按阳性率，，=每个视野中的，阳性细胞数／同视野中细胞总数计算出阳性率10个视野取平均阳性率为13．PCNA增殖指数。统计学处理使用22．SPSS110．统计软件利用双因素及单，一因素方差图2SZl2、分析等方法进行统计学分析结果1。S100A6RNA干扰细胞SZ23：系中S100A6基因表迭检测；SZ31、为$100A6RNA干扰载体稳定转染细胞IMG：；用RT—PCR法及免疫细胞化学法鉴定胃腺癌细胞株SZ45：为点突变对照栽体稳定转染细胞上；为转染IMG800栽体的—SGC7901中S100A6基因表达情况SGC7901细胞列条带为S100A6；下列条带为Bactin内对照图3转染细胞的$100A6基因表达(SP×200)左：稳定转染突变对照载体的SZ45；右：稳定转染S100A6RNA干扰栽体的SZl2现代肿瘤医学23．2010年2月第!!鲞箜至翅细胞周期结果显示bloSZl2、󰀀223󰀀Westenbloting法检测细胞内SlOOA6蛋白表达SZ23组处于GoSZ31SZ45、—G。期的细胞比提取染IMG800，SIOOA6RNA干扰细胞系点突变对照细胞系和转，例显著高于点突变对照组的SGC7901细胞(P<．和转染IMG800空载体S载体的SGC7901细胞的总蛋白进行WeWestensten005．)而处于，期的细胞比例均显著一ting检测结果两RNA干扰细胞系对应的Weste条带灰度载体的(见低于其它三组(P表1)<005<)，SZl2，组G2M期细胞比例显著也明显弱于点突变对照细胞系和转染SGC7901IMG800高于其它四组细胞(P。005．)其它各组均无显著差异(见细胞所对应的n条带．。根据抑制率公式计算，的蛋白表达抑制率图4)。SZl2组为847％SZ23组为702％．表1流式细胞仪检测$100A6基因RNA干扰对细胞周期影响结果$223SZl2SZ45SZ31IMG7901(％；±s)，{表示与其它三组．比较有显著差异，P<005．#；与其他4组比较P005．)后两组之间无显著差异(P、、005．．)。、SZ23、．组料氆漤盥挂每日平均细胞计数在第5X×rnl10／’’，67日分别为O96．××10／ml’’126．156．Xrnl10／’和084×10／ml12，．’10／ml164、．10／ml显，著低于其它各组的计数值(P<005)(见图5)。l23456图6平板克隆形成实验法检测SIOOA6基因RNA干扰对细胞增殖状态的影响1：为转染ING800空栽体的SGC7901细胞；2：SZ31组；3：SZ45：0乓bH4为SZl2组；5：SZ23组；6组；为未处理的SGC7901细胞24．．5Transwdl穿膜实验检测细胞侵袭力．结果显示各×V组细胞的迁徙率分别为02左右SZl2，、SZ23组迁徙率为、糕太(O．05、±001．)(0、．09±002．)显著低于点突变对照组SZ31IMGS00翟恩1O5．SZ45未处理的)(见图7)PCNA．SGC7901<细胞和转染空载体的SGC7901>．细胞组(P。0．05)。其余各组之间无显著差异(P结果显示各组细胞的增殖指．005．246．增殖指数检测，、0一数在0(0培养时间(d)SIOOA6．70左右SZl2．SZ23组增殖指数为(0、25±0．11)、O5．38±121，)均显著低于点突变对照组IMG800SZ31SZ451、未处理细胞组8的SGC790细胞和转染空载体的SGC790>图5242．．基因RNA干扰对细胞生长状态的影响(P<0．05)其余各组之间无显著差异(P005．)(见图)。流式细胞仪检测细胞周期结果流式细胞仪法检测MODERNONCOLOGY．Feb2010．，VOI18．．NO2．排列O-3。在许多肿瘤中都存在该区的缺失或者重排扩增现象H“，提示该家族基因在肿瘤发生发展中发挥作用、’。关于一S100A6O25．目前的研究，”。叫认为是与细胞钙离子代谢相关的，种分子参与细胞的周期调控和增殖分化还能够与原肌球蛋白，annexinsII，XI0-2作用并作为调钙蛋白的结合蛋白，褂(calde015．smon)。国外已有部分研究报道，，S100A6在多种肿瘤S100A6。蓑型恳中广泛存在如肝癌结肠癌胰腺癌乳腺癌等腺癌以及黑，，色素瘤中有较高表达01．。““’’，这些结果可能提示在这结些肿瘤的发生SIOOA6、发展中可能具有某些功能研究表明一在肿瘤浸润边缘表达高于肿瘤的其他部位这，005．果提示S100A6可能还与肿瘤细胞向周围组织浸润侵袭的恶。性生物学行为有关0l234但S100A6。在细胞中的作用以及其在肿S100A6瘤中的确切功能意义仍不明确56，与胃癌的关系国内外目前缺乏研究北京肿瘤医院吕有勇等报道用大蒜素处理胃癌细胞株BGC823图7Transwell穿膜实验法检测S100A6基因RNA干扰对细胞后用代表性差异显示发现S100A6在，一侵袭力的影响l4：2：为SZ31组；3：SZ45组为转染IMG800空载体的SGC7901细胞；：处理后表达明显上升提示有控制分化的功能这，，结果似；5：sZ23组；6为SZl2组：为未处理的SGC7901细胞乎与以往国外研究认为的结论相左。S100A6对肿瘤发生发展有促进作用一3讨论SIOOA6本研究使用分子克隆技术进。步验证了其在是一种由90个氨基酸残基组成的蛋白分子其，。胃癌细胞中的功能意义SGC7901方法则采用在人胃癌细胞系一开放阅读框架(ORF)包扩270个碱基属于S100蛋白家基础上建立S100A6敲低细胞系进。步明确其在肿族该家族含有，20多个成员大部分在染色体，1q21区密集瘤细胞中的功能意义A09󰀀O8󰀀0706．羹4翼。一0—50-30-20l󰀀O2B3456图8ABPCNA染色法检测S100A6基因RNA干扰对细胞增殖状态的影响：图申1：2：为SZ31组；43：为SZ45组；为转染IMG800空载体的SGC7901细胞；×5为SZl2组；RNAi：6为SZ23组；：为未处理的SGC7901细胞。图为PCNA染色表达情况(SP200)其中左为转染点突变对照载体细胞系右为转染，，栽体细胞系建立目的基因表达减低细胞系的方法主要有目的基因反义转染反义、列同源的双链legcingRNA(doublestrandedRNA—，dsRNAiption)所诱导的aRNA法特异性核酶法和、RNA干扰。国内特异性转录后基因沉默现象(postn，transcrlgenesi一已有学者”“”0采用反义核酸技术和RNAi技术在。SGC7901PTGS)。细胞上成功建立了相应基因表达敲低的细胞系RNA干扰研究通过免疫细胞化学法验证筛选出的稳定转染、RTPCR、Westenbloting。等方是近年兴起的其它方法，一项减低目的基因表达的新方法较之上述的，RNA干扰载体的细胞结果证实，RNA干扰具有抑制效率高靶向特异性好对细胞，，稳定转染细胞系中已有明显的S100A6表达降低本研究进其它方面影响小实验花费较低等优点，。RNA干扰为与靶序行细胞生物学研究时也主要研究了与肿瘤细胞恶性表型相现代肿瘤医学２０１０年２月第１８卷第２期　・２２５・　关的生物学特性，同样采用生长曲线法、平板克隆形成实验　ｉｎｇ　ｏｆ　ｅａｌｅｙｃｌｉｎ　ｔｏ　ｍｕｓｃｌｅ　ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，１９９６，２２０：３６０—３６５．　法、流式细胞仪法和ＰＣＮＡ染色法等方法检测了Ｓ１００Ａ６表　达敲低细胞株的生长状态，增殖状态，细胞周期、凋亡和侵袭　转移能力。生长曲线法的结果显示Ｓ１００Ａ６敲低细胞株生长　［８］　Ｆｉｌｉｐｅｋ　Ａ，Ｗｏｊｄａ　Ｕ，Ｌｅｓｎｉａｋ　Ｗ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｃａｙｃｌｉｎ　ｎｄ　ａｉｔｓ　ｃｙ—　ｎｏｇｅｎ　ｖｒｏｍｉａｄｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｎｎｅｘｉｎ　ＩＩ　ａｎｄ　ｇｌｙｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３一　速度与转染空载体、及空白对照细胞相比有显著差异，平板　克隆形成实验法结果也显示Ｓ１００Ａ６敲低细胞株增殖速度显　著低于对照。综合对￥１００Ａ６敲低细胞株研究提示Ｓ１００Ａ６　基因可能有促进细胞生长、增殖作用，确证了该基因的生长　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１９９５，２７：　１１２３一ｌ１３１．　［９］　Ｍａｎｉ　ＲＳ，ＭｃＣｕｂｂｉｎ　ＷＤ，Ｋａｙ　ＣＭ．Ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｇｒｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｄｅｓｍｏｎ　ｂｙ　ａｎ　１１——ＫＤａ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃａｌｃｉｕｍ——ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏ－　ｔｅｉｎ，ｅａｌｔｒｏｐｉｉｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，３１：１１８９６—１１９０１．　促进作用。本研究在细胞凋亡检测方面采用了流式细胞仪　法，但检测结果显示各组细胞的调亡比例均为１．５％左右，凋　［１０］　Ｓｕｄｏ　Ｔ，Ｈｉｄａｋａ　Ｈ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｃｙｅｌｉｎ（Ｓ１００Ａ６）ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｙ　ｌｔａｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐｈｅｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｎ—－ｔｅｒｍｉｎａ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ａｎｎｅｘ－　亡率较低，尚不能认定实验组与对照组之间存在差异。下一　步实验将采取其它辅助方法研究，￥１００Ａ６基因是否参与细　胞的凋亡过程。　综合Ｓ１００Ａ６敲低细胞株Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ穿膜实验检测结果　可显示Ｓ１００Ａ６基因对肿瘤细胞穿膜能力有显著影响，当其　表达降低时细胞穿膜能力下降，反映其侵袭转移能力减弱。　原因也有待进一步研究证实。本项研究的主要结论为　Ｓ１００Ａ６基因有促进细胞生长增殖作用，同时可影响细胞周　期增加分裂期细胞，并具有较强提高肿瘤细胞侵袭转移能力　的作用，但实验中也存在细胞系相对单一等不足。在下一步　的研究中将采取多株不同的胃癌细胞系对本研究结果加以　验证，同时结合动物实验作深入研究，力求较深入的探讨　Ｓ１００Ａ６基因及Ｓ１００家族与胃癌发生、发展的关系，从而明　确其与胃癌的关系及将来作为抑制胃癌生长、浸润及转移靶　位点的可能性。　【参考文献】　［１］Ｆｅｒｒａｒｉ　Ｓ，Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ　Ｂ，ｄｅＲｉｅｌ　ＪＫ，ｅｔ　１ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｇｒｏｗｔｈ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ，ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｅａｌｃｙｃｌｉｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９８７，２６２（１７）：８３２５—８３３２．　［２］杨少波，王孟薇，邵勇，等．应用ｃＤＮＡ微阵列芯片筛选胃癌相　关基因［Ｊ］．肿瘤防治杂志，２００４，１１（２）：１１７—１２０．　［３］　贺慧颖，方伟岗，郑杰，等．丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶５调节　人前列腺癌细胞生长及侵袭的信号转导机制研究［Ｊ］．中华医　学杂志，２００３，８３：１８１２—１８１７．　［４］　Ｍａｅｌａｎｄｓｍｏ　ＧＭ，Ｆｌｏｒｅｎｅｓ　ＶＡ，ＭｅＨｉｎｇｓａｅｔｅｒ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ４　ａｎｄ　Ｓ１００Ａ６　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｒｏ—　ｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍｅｌａｎｏｍａ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９７，７４　（４）：４６４—４６９．　［５］ＩＩｇ　ＥＣ，Ｓｃｈａｆｅｒ　ＢＷ，Ｈｅｉｚｍａｎｎ　ＣＷ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｎｒ　ｏｆ　Ｓ１００　ｃａｌｃｉｕｍ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，　１９９６，６８：３２５—３３２　［６］Ｅｔｈｎａ　ＤＥ，Ｌｅｉｓｈ　ＣＭ，Ｐｅｔｅｒ　ＨＷ．Ｓ１００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｎａｄ　ｈｔｅｉｒ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｎ　ｐｒｏ—ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｉｎ　ｃｎａｃｅｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２００４，　８２：５０８—５１５．　［７］Ｇｏｌｉｔｓｉｎａ　ＮＬ，Ｋｏｒｄｏｗｓｋａ　Ｊ，Ｗａｎｇ　ＣＬ，ｅｔ　１ａ．Ｃａ２　一ｄｅｐｅｄｅｎｔ　ｂｉｎｄ．　ｉｎ　ＸＩ　ｉｓｏｆｏｒｍｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３：６３５１—６３５７．　［１１］　Ｋｏｍａｔｓｕ　Ｋ，Ａｎｄｏｈ　Ａ，Ｉｓｈｉｇｕｒｏ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ１００Ａ６（Ｃａｌｅｙｃｌｉｎ），ａ　ｃａｌｃｉｕｍ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｌ００　ｆａｍｉｌｙ，ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｒｅｅｔａｌ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ『Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２０００，６（１）：１７２—１７７．　［１２］Ｓｔｕｌｉｋ　Ｊ，Ｏｓｔｅｒｒｅｉｃｈｅｒ　Ｊ，Ｋｏｕｐｉｌｏｖａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｆｅｅｒｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｔｅ　Ｃａ“ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓ１００Ａ６　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ，ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ａｎｄ　ｎｅｏｐｌｓａｔｉｃ　ｃｏｌｏｎ　ｍｕｃｏｓａ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２０００，３６（８）：１０５０—　１０５９．　［１３］Ｋｏｍａｔｓｕ　Ｋ，Ｍｕｒａｔａ　Ｋ，Ｋａｍｅｙａｍａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ１００Ａ６　ｎａｄ　Ｓ１００Ａ４　ｉｎ　ｍａｔｃｈｅｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｏｌｏｒｅｃｔｌａ　ｍｕｃｏｓａ，ｐｒｉ—　ｍａｒｙ　ｅｏｌｏｒｅｅｔｌａ　ａｄｅｎｏｅａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｍｅｔｓａｔｓａｅｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌｏ－　ｇＹ，２００２，６３（２）：１９２—２００．　［１４］Ｊｏ　ＪＨ，Ｋｉｍ　ＪＷ，Ｌｅｅ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ＮＦ—ｋａｐｐａＢ　ｉｎ　ｈｔｅ　ｅｒｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ１００Ａ５　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　ＨｅｐＧ２［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００３，３０７　（２）：２７４—２８０．　［１５］　Ｃｍｏｇｏｒａｅ—Ｊｕｒｃｅｖｉｃ　Ｔ，Ｍｉｓｓｉａｇｌｉａ　Ｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌａｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｐａｎ－　ｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｅｘ・　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ１００　ｇｅｎｅｓ　ｉｓ　ｈｉｓｈｌｙ　ｐｒｅｖｌａｅｎｔ［Ｊ］．Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，２００３，２０１　（１）：６３—７４．　［１６］Ｓｈｅｋｏｕｈ　ＡＲ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＣＣ，Ｐｒｉｍｅ　Ｗ，ｅｔ　１ａ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｓａｅｒ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｍｉｅｒｏｄｉｓｓｅｅｔｉｏｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｗｏ——ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏ—　ｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｕｅｔｌａ　ａｄ　［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅｓ，２００３，３（１０）　１９８８—２０ｏ１．　ｌ　１７　Ｊ　Ｗｅｔｅｒｍａｎ　ＭＡ，ｖａｎ　Ｍｕｉｊｅｎ　ＧＮ，Ｂｌｏｅｍｅｒｓ　ＨＰ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｃｙｃｌｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｅ　ｌｅｓｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９３，　ｌ５　１６０６１—６０６６．　［１８］　高福莲，王峰，吴景兰，等．靶向人胃癌ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞多　药耐药基因１小分子干扰ＲＮＡ的有效序列筛选［Ｊ］．中华肿　瘤杂志，２００６；２８（３）：１７８—１８２．　［１９］　马荣，陈曦海，张岂凡，等．反义核酸增强胃癌细胞对多西他赛　敏感性及其逆转耐药机制的探讨［Ｊ］．中华肿瘤杂志，２００７，２９　（２）：８９—９２．　（编校：张志明）　

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