沉默S100A4基因对乳腺癌上皮间质转换的影响

窑650窑西南国防医药2019年6月第29卷第6期24h后袁能剂量依赖地将细胞周期阻滞在G2/M期中袁一定程度地减缓细胞正常有丝袁起到抑制细胞增殖的作用遥综上所述袁CJ016能有效地阻滞H1975细胞增殖袁诱导细胞发生凋亡袁起到延缓或抑制肿瘤细胞恶性传代的作用袁具有一定的抗肿瘤作用遥[1]孙丽婷袁刘萍袁李加肖袁等.共轭亚油酸异构体对人乳腺癌2016,32(3):443-444.MCF-7细胞增殖的抑制和促凋亡作用[J].中国药理学通报,王敏.人参皂苷Rh2促进人子宫内膜癌细胞凋亡及其机制研究[J].西南国防医药,2018,28(8):720-723.代晓丽,刘静,年寅,等.环阿尔廷烷型四环三萜化合物对报,2018,34(1):91-96.[2][3]HCT116细胞增殖尧细胞周期和凋亡的影响[J].中国药理学通朱文赫,陈丽红,许娜,等.双氢青蒿素诱导人肝癌细胞53(3):187-192.[4]SMMC-7721凋亡及其分子机制研究[J].中国药学杂志,2018,陈飞燕袁陶伟伟袁陈扣玉袁等.京大戟中二萜类化合物pekinenal2016,32(4):519-524.A院空白对照组曰B院PTX组袁20nmol/L曰C院CJ01610nmol/L曰D院CJ01620nmol/L[5]对肝癌细胞增殖尧周期和凋亡的影响[J].中国药理学通报,陈智袁王博袁裘玫袁等.对香豆酸组合物对白血病细胞的增殖抑制作用及机制[J].中国药学杂志,2017,52(17):1503-1509.孟令旗袁刘畅袁孙虎男袁等.醌茜素对人肺癌A9细胞增殖尧1625-1926.体外能有效抑制H1975细胞增殖袁本课题组观察到袁当CJ016给药浓度高于20nmol/L时袁镜下观察可见细胞数量明显减少袁细胞皱缩变圆袁半贴壁或漂浮死亡遥且随给药浓度不断增加袁抑制作用也随之增强袁呈现出较广的治疗窗口遥同时袁随着作用时间的延长袁其对肿瘤细胞的抑制效果也相应增加遥流式检测结果发现袁10nmol/L的CJ016处理H1975细胞48h后袁凋亡细胞比例渊17.62%冤较空白对照组渊0.732%冤明显增多袁凋亡细胞大多处在晚期凋亡中曰而20nmol/L的CJ016诱导细胞凋亡比例渊26.92%冤高于10nmol/L组袁存在一定的剂量效应关系袁且略优于阳性对照紫杉醇组渊20.29%冤遥表明CJ016能有效诱导H1975细胞发生凋亡袁从而抑制肿瘤细胞恶性增殖遥从图3也可以看出袁CJ016处理H1975细胞[6][7]凋亡的影响及初步机制研究[J].中国药理学通报,2016,32(11):唐守龙袁张晓成袁陆航.辛二酰苯胺异羟肟酸对结肠癌HCT116和SW480细胞增殖尧周期和凋亡的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2017,24(10):1081-1087.[8][9]杨柳袁黄科袁杨燕袁等.五味子和芍药醇提取物对气道成纤维细胞增殖的影响[J].西南国防医药,2016,26(10):1093-1095.渊收稿日期院2018-10-25冤李丽春袁陈[]瑶袁付梅袁何谦响遥采用蛋白免疫印迹法(Westernblot)和荧光实时定量渊RT-PCR冤检测S100A4在人乳腺癌组织中的表达情况遥用RNA成观察沉默人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中钙结合蛋白S100A4基因对上皮间质转换渊EMT冤的影干扰技术将针对S100A4和非特异性阴性对照序列的siRNA转染至人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞袁采用RT-PCR和Westernblot方法检测EMT相关分子渊E-cadherin,N-cadherin尧Snail和Slug冤的表达在沉默组和对照组中的表达水平遥cadherin表达水平上调遥功建立S100A4基因沉默的人乳腺癌MCF-7和MAD-231细胞模型曰二者细胞中N-cadherin尧Snail和Slug表达水平降低袁而E-S100A4通过调节EMT过程袁促进乳腺癌的侵袭和迁移袁其可能成为乳腺癌治疗新的靶标分子遥院610041成都袁四川大学华西医院门诊院何谦袁E-mail院1290131935@qq.com西南国防医药2019年6月第29卷第6期[]S100A4基因曰乳腺癌曰上皮间质转换曰基因沉默曰EMT相关蛋白1004-0188渊2019冤06-0650-05R737.9窑651窑Adoi:10.3969/j.issn.1004-0188.2019.06.006LiLichun,ChenYao,FuMei,HeQian610041,China[]OutpatientDepartment,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan,WesternblotandRT-PCRwereusedtotesttheexpressionofAcellmodelofproteinA4(S100A4)inMCF-7andMDA-MB-231cells.Toobservetheimpactonepithelial-mesenchymaltransition(EMT)bysilencingS100calcium-bindingS100A4inhumanbreastcancertissue.RNAinterferencewasusedtotransfectthesiRNAtargetingS100A4andnon-specificnegativerelatedmolecules(E-cadherin,N-cadherin,SnailandSlug)inthesilencinggroupandthecontrolgroup.andSluginbothcellswasinhibited,whiletheexpressionofE-cadherinwasup-regulated.relatedprotein[controlsequencetoMCF-7andMDA-MB-231cells,andthenRT-PCRandWesternblotwereusedtotesttheexpressionofEMT-S100A4willpromotetheMCF-7andMAD-231wassuccessfullyestablishedonthebasisthatS100A4genewassilenced.TheexpressionofN-cadherin,SnailinvasionandmigrationofbreastcancercellsbyadjustingEMT,makingitanewpossibletargetmoleculetocurebreastcancer.]S100A4gene;breastcancer;epithelial-mesenchymaltransition,genesilencing;epithelial-mesenchymaltransition-年其在诊断和治疗方式上都有一定的进展袁但是其皮间质转换渊EMT冤在细胞分化过程中发挥着重要的乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一[1]袁近几Lifetechnology公司,BCA蛋白浓度检测试剂盒尧5年生存期仍然较低袁主要原因是其发生转移[2]遥上作用袁近年来在肿瘤的演进中受到关注袁并且认为其是导致肿瘤侵袭转移的主要机制之一[3]遥有文献报道袁其参与乳腺癌的侵袭和转移[4]遥EMT过程中袁上皮细胞标志物E-cadherin下降袁间质细胞标志物同时Slug尧Snail作为转录因子也参与EMT过程[6]遥N-cadherin上调袁导致细胞获得一定的运动能力[5],S100A4基因定位于1号染色体长臂2区1带袁RIPA细胞裂解液裂解均购自上海碧云天生物技术司合成袁Lipoctamine2000购自美国ThermoFisherScientific公司袁实验所用一抗渊茁-actin袁Slug袁N-cadherin袁S100A4和Snail冤均购自美国CellSignalingTechnology有限公司遥所用引物由武汉金开瑞生物工程有限公公司袁E-cadherin购自美国Abcam公司袁抗兔IgG(H+L)尧抗鼠IgG(H+L)尧SuperECLPlusWesternBlottingSubstrate化学发光显影液尧DEPC水均购自上海碧云天生物技术有限公司曰凝胶图像分析系统和PCR仪均购自美国Bio-Rad公司遥细胞与组织标本MCF-7和MDA-MB-231细胞于37益尧5%CO2尧95%大气条件下培养袁每2d更换一次培养基遥本实验所用细胞均处于对数生长期遥组织样本来自医院乳腺外科收治的4例乳腺癌患者袁均经3位病理医生诊断,组织学类型均为原发浸润性导管癌遥肿瘤组织和正常组织标本分别取自瘤体和距离瘤体2cm外正常乳腺组织遥本研究经医院医学伦理委员会的批准袁所有参与研究的患者知晓本研究并签署了知情同意书遥细胞转染和分组将S100A4和非特异性阴性对照序列的siRNA分别转染至人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞袁分别作为S100A4基因沉默组渊基因沉默组冤和阴性对照组袁转染步骤按脂质体Lipoctamine2000说明书操作遥Westernblot实验Westernblot实验检测S100A4蛋白在人乳腺癌组织样本中的表达水平以及S100A4尧N-cadherin尧E-cadherin尧Slug尧Snail蛋白在基因沉默组和阴性对照组中的表达水平遥方法概述如下院转染了siRAN和阴性对照的细胞或者新鲜其表达的蛋白是钙结合蛋白S100家族的主要成员之一袁其主要功能是调节细胞粘附能力遥有研究报道袁S100A4在乳腺癌尧胃癌尧鼻咽癌尧甲状腺癌尧膀胱癌等肿瘤组织中高表达[7-8]遥有文献提示袁S100A4可能也参与与乳腺癌的侵袭和转移袁并且与乳腺癌的临床病理参数以及预后相关袁但S100A4是否是通过调节EMT过程进而影响乳腺癌的临床病理变化及预后[9]袁目前尚未完全清楚遥因此袁本实验研究了沉默S100A4基因对乳腺癌EMT过程的影响袁为进一步阐明乳腺癌的发病机制提供理论依据遥主要试剂与设备MCF-7和MDA-MB-231细胞购自上海生物制品研究所曰S100A4和非特异性阴性对照序列的siRNA购自上海生博生物医药科技有限公司曰胎牛血清和青尧链霉素溶液尧DMEM购自美国Gibco公司袁TRIzol和RT试剂盒购自大连TaKaRa公司,SYBRGreenPCR混合液购自美国窑652窑组织收集于1.5ml的EP管中袁用RIPA细胞裂解液裂解RIPA袁BCA方法测量蛋白浓度转膜袁调整至相同的浓度用含5%脱脂奶粉封闭液封闭袁蛋白样品上样电泳遥实验的蛋白样本用2h袁一抗孵育过2h后夜(4益)曰次日用TBST浸洗1h袁然后用对应的二抗孵育Western2h袁TBST浸洗45min袁最后用Super样cadherin尧Slug尧Snail本中RTBlottingSubstrate化学发光显影液显影ECL遥Plus的-PCR表达检测水S100A4基因在人乳腺癌组织默组冤和阴性对照组基因在平以及渊对照组S100A4S100A4尧N冤中的表达水平基因沉默组-cadherin尧E遥方法渊沉-概述如下mRNA袁应合成cDNA遥按逆转录试剂盒说明书进行院采用TRIzol法提取组织样本或者细胞反应体系如下院2滋g的RNAmRNA逆转录反加8滋l的5伊primeScriptmix缓冲液袁然后用DEPC水补充至RT基因表达的相对差异用循环数试剂盒和40滋l遥然后进行实时荧光定量SYBRGreenPCR试剂盒说明书PCR袁方法参照遥ct值用(ct)表示袁每个样品的各组统计学方法B-actin进行校正应用袁PASWStatistics统计软件进行分析袁GraghpadPrism6.2软件进行统计图制作遥计量数据以x依s表示袁多组比较时行方差分析法袁两组比较行样本检验袁<0.05为差异有统计学意义遥平比较S100A4Western基因和蛋白在乳腺组织中的表达水blot实验结果显示袁S100A4蛋白在乳腺癌组织中表达明显上调(表1)曰RT-PCR实验结果显示袁S100A4基因在乳腺癌组织中表达明显上调渊表2冤遥表1 S100A4蛋白在乳腺癌组织及正常组织表达比较 样本来源 组织样本 S100A灰度值 病例 1 正常组织 14.93±1.22 乳腺癌组织 108.16±9.65①

病例 2 正常组织 137.72±11.32 乳腺癌组织 188.23±6.26① 病例 3 正常组织 36.24±5.65 乳腺癌组织 121.51±16.31① 病例 4

正常组织 19.19±3.26 乳腺癌组织

70.36±6.32①

注：与正常组织比较，①P < 0.05

中的表达水平比较S100A4基因和蛋白在转染WesternblotsiRNA实验分析显示乳腺细胞袁乳腺癌细胞转染siRNA后袁S100A4蛋白表达水平下调(MCF-7细胞院渊104.1依11.36冤vs渊61.61依9.96冤曰MDA-西南国防医药2019年6月第29卷第6期表2 S100A4基因在乳腺癌组织及正常组织表达比较 标本来源 组织样本 S100A 病例1 正常组织 19.65±0.

乳腺癌组织 28.88±0.14①

病例2 正常组织 20.14±0.25 乳腺癌组织 29.74±0.58①

病例3 正常组织 16.87±0.68 乳腺癌组织 26.56±0.22① 病例4

正常组织 19.31±0.73

乳腺癌组织

28.32±0.①

注：与正常组织相比，①P < 0.05

MB实验也显示-231细胞袁院渊185.23依10.冤vs渊136.78依9.32)曰RT乳腺癌细胞转染siRNA后袁S100A4-PCR基因表达水平降低0.65冤曰MDA(MCF-7细胞院渊31.87依0.15冤vs渊23.11依0.09冤遥-MB-231细胞院渊26.61依0.03冤vs渊20.52依基因沉默组与阴性对照组EMT相关蛋白和基因表达水平比较渊Westernblot渊表3冤和RT-基表4冤实验结果显示袁NPCR-cadherin尧Snail尧Slug蛋白和cadherin因表达明显上调水平在遥基因沉默组明显降低袁而E-乳腺癌是发生于女性群体中最常见的恶性肿瘤之一遥肿瘤侵袭至周围组织和发生转移是导致乳腺癌患者预后差的主要因素之一S100家族参与调节多种肿瘤的侵袭和转移遥有文献报道袁[10-11]实验证明袁S100家族的重要的成员之一S100A4遥本在乳腺癌组织中的表达明显上调袁与Wang等[11]的报道一致遥提示S100A4可能参与乳腺癌的生物学行为的调节遥EMT参与结直肠癌尧乳腺癌尧卵巢癌等多种肿瘤侵袭和转移遥有文献报道袁S100A4参与调节人卵巢癌[12]尧胰腺癌[13]尧肝细胞肝癌[14]等的EMT过程遥EMT过程中袁上皮细胞相关标志物E-cadherin明显下调Snail袁间质相关标志物N-cadherin明显上调袁子遥和本实验结果显示Slug是参与调节袁沉默EMTS100A4过程的重要的转录因的乳腺癌细胞能上调E-cadherin表达水平袁下调N-cadherin尧Snail和Slug的表达袁提示S100A4参与调节EMT过程遥有文献报道袁敲低S100A4能抑制Src-FAK信号通路的激活[15]等[13]报道袁S100A4,此信号通路的激活能促进通过调节Shh-Gli1信号通路EMT[16-17]遥袁Xu进而参与EMT的调节遥故推测在人乳腺癌中袁S100A4通过激活Src-FAK或者Shh-Gli1信号通路袁进而激活EMT过程遥Rudland等[18]报道袁S100A4与乳腺癌患者的预后呈现负相关遥本实验证明袁S100A4参与西南国防医药2019年6月第29卷第6期表3 沉默组与对照组EMT相关蛋白表达水平比较(n=3)

组别

细胞株 MCF-7

MDA-MB-231

N-cadherin 1.67±21.12

①

窑653窑E-cadherin .83±13.23

①

Slug 133.66±12.66 77.94±11.25 171.44±22.23

①

①

Snail 195.78±15.32 149.41±12.97 80.85±19.66

①

①

阴性对照组

基因沉默组 阴性对照组

基因沉默组

94.49±16.33 87.67±9.32 81.84±12.36 3.12±0.03

①

40.50±6.65 82.99±11.25

93.74±14..56 40.07±10.01

①

注：与阴性对照组比较，①P < 0.05

表4 沉默组与对照组EMT相关基因表达水平比较(n=3)

组别

细胞株

N-cadherin 26.63±0.22 16.36±0.65① 29.65±0.98 21.05±0.58

①

E-cadherin 16.±0. 15.65±0.62

①

Slug 21.36±0.67 23.33±0.

①

Snail 16.37±0.24 19.69±0.97

①

阴性对照组 MCF-7 基因沉默组

阴性对照组 MDA-MB-231 基因沉默组

26.38±0.① 13.65±0.26① 22.35±1.98① 26.32±0.55 15.69±0. 26.36±0.88

注：与阴性对照组比较，①P < 0.05

调节乳腺癌的EMT过程袁而EMT是导致患者发生转移的主要机制之一袁推测S100A4可能上调EMT过程袁导致乳腺癌患者发生转移袁进而影响患者的预后遥综上所述袁S100A4通过调节EMT过程袁促进乳腺癌的侵袭和迁移袁其可能成为乳腺癌治疗新的靶标分子遥[1]AzimHA,deAzambujaE,ColozzaM,etal.Long-termtoxic解剖科学进展,2018,24(4):3-367[9]LimTumor-infiltratingSY,Yuzhalinmonocytes/macrophagesAE,Gordon-WeekspromoteAN,ettumoral.invasionandmigrationbyupregulatingS100A8andS100A9[10]expressionincancercell[J].Oncogene,2016,35(44):5735-5745.TianT,LiX,Hua,Zetal.S100A7promotesthemigration,invasionandmetastasisofhumancervicalcancercellsthrough249-24977.epithelial-mesenchymaltransition[J].Oncotarget,2017,8(15):[11]WangL,WangX,LiangY,etal.S100A4promotesinvasionandeffectsofadjuvantchemotherapyinbreastcancer[J].AnnOncol,2011,22(9):1939-1347.LvZD,KongB,LiuXP,etal.CXCL12chemokineexpressionandinvivo[J].IntJClinExpPathol.2014.7(10):6671-6678.Zhangepithelial-mesenchymal1711.J,YaoH,SongtransitionG袁etbyal.Regulation[12]angiogenesisinbreastcancerMDA-MB-231cellsbyupregulating593-598.matrixmetalloproteinase-13[J].ActaBiochimPol,2012,59:YanW,ChenJ,ChenZ,etal.DeregulatedmiR-296/S100A4[2]suppresseshumanbreastcancergrowthandmetastasisinvitroofaxispromotestumorinvasionbyinducingepithelial-mesenchymal(2):260-269.[3]transitioninhumanovariancancer[J].AmJCancerRes,2016,6[13]XuX,SuB,XieC,etal.Sonichedgehog-Gli1signalingpathwayregulatestheepithelialmesenchymaltransition[J].PLoSOne,2014,9(7):e941.andepithelial-mesenchymalmediatinganewtargetgene,S100A4,inpancreaticcancercells[14]DouC,LiuZ,XuM,etal.miR-187-3pinhibitsthemetastasiscarcinomabytargetingS100A4[J].CancerLett,2016,381(2):[15]380-390.CheP,YangY,HanX,etal.S100A4promotespancreaticcancerprogressionthroughadualsignalingpathwaymediatedbySrcandfocaladhesionkinase[J].SciRep,2015,5:8453.ChenJS,HuangXH,WangQ,etal.FAKisinvolvedintransitionofhepatocellular(EMT)bymacrophagesincancer[J].AmJTranslRes,2015,7(10):1699-[4]WuY,WangY,LinY,etal.Dub3inhibitionsuppressesbreasttumor-associatedcancerinvasionandmetastasisbypromotingSnail1degradation[J].NatCommun,2017,8:14228.HanX,WangL,NingY,etal.Longnon-codingRNA[5]AFAP1-AS1facilitatestumorgrowthandpromotesmetastasisincolorectalcancer[J].BiolRes,2016,49:36.[6]factorsSlug(SNAI2)andSnail(SNAI1)regulatephospholipaseDMolOncol,2016,10(5):663-676.GanesanR,MalletsE,Gomez-CambroneroJ.Thetranscription(PLD)promoterinoppositewaystowardscancercellinvasion[J].[7]XuH,LiM,ZhouY,etal.S100A4participatesinMMP2[J].TumourBiol,2016,37(3):2925-2932.[16]invasionandmetastasisofhepatocellularcarcinoma[J].ClinExpMetastasis,2010,27:71-82.SunCK,ManK,NgKT,etal.Proline-richtyrosinekinase2epithelial-mesenchymaltransitioninbreastcancerviatargeting赵滢,高立红,王楠,等.siRNA介导S100A4基因沉默对胃癌[17][8](Pyk2)promotesproliferationandinvasivenessofhepatocellular2008,29:2096-2105.细胞中MMP-2和E-cadherin表达及细胞侵袭能力的影响[J],carcinomacellsthroughc-Src/ERKactivation[J].Carcinogenesis,窑6窑[18]RudlandPS,Platt-HigginsA,RenshawC,etal.Prognosticsignificanceofthemetastasis-inducingproteinS100A4(p9Ka)inhumanbreastcancer[J].CancerRes,2000,60(6):1595-603.西南国防医药2019年6月第29卷第6期渊收稿日期院2019-01-20冤罗加国袁高[]哲袁蒋丹袁黄堂辉了解成都市社区精神卫生防治渊简称野精防冶冤人员的心理健康状况与工作态度渊包括工作满意度尧职业倦怠及离职意向冤袁探讨其心理健康与工作态度的关系遥分析其一般情况尧心理健康尧工作态度遥值水平之上遥[采用整群抽样法袁选取成都市163名社区精防人员为研究对象袁调查31.29%的社区精防人员SCL-90得分高于全国常模曰79.1%的社区精防人员工作总体满意度处于中值及以下水平袁62.6%的社区精防人员存在不同程度的职业倦怠袁22.1%的社区精防人员离职意向得分在中成都市社区精防人员的心理健康尧工作满意度尧职业倦怠尧离职意向现状不容乐观袁应采取积极有效的措施改善其心理健康水平袁提高其工作满意度袁降低职业倦怠袁减少离职意向遥]成都曰社区曰精神卫生防治曰心理健康曰调查1004-0188渊2019冤06-06-04R395.4Adoi:10.3969/j.issn.1004-0188.2019.06.007LuoJiaguo,GaoZhe,JiangDan,HuangTanghuiChengduJinxinMentalDiseasesHospital,Chengdu,Sichuan,610000,China[]turnoverintention)ofcommunitymentalhealthprofessionalsinChengdu,andexplorethecorrelationbetweentheirmentalhealthandworkingattitude.enrolledinthestudy.Theirgeneralinformation,mentalhealthandworkingattitudeweresurveyedandanalyzed.Basedontheclustersampling,atotalof163communitymentalhealthprofessionalsinChengduwereTheTounderstandthementalhealthandworkingattitude(includingworksatisfaction,jobburnoutandprofessionalswithaSCL-90scoreabovethenationalnormaccountedfor31.29%,thosewithanoverallworksatisfactionnothigherthanthemedianaccountedfor79.1%,thosewithdifferentextentsofjobburnoutaccountedfor62.6%,andthosewithascoreofturnoverintentionabovethemedianaccountedfor22.1%.burnoutandturnoverintentionofmentalhealthprofessionalsinChengduallowsnooptimism.Activeandeffectivemeasuresshallbetakentoimprovetheirmentalhealth,lifttheworksatisfaction,eliminatethejobburnoutanddecreasetheturnoverintention.turnoverintention;survey[]Chengdu;community;preventionandtreatmentofmentalillness;mentalhealth;worksatisfaction;jobburnout;Thestatusquoofthementalhealth,worksatisfaction,job社区精神卫生防治渊简称野精防冶冤工作是一项人际敏感复杂的特殊服务工作袁有研究显示袁社区精防人员普遍感觉从事精防工作有困难[1]袁加之工作风险高尧福利待遇低尧职业前景渺茫等原因[2]袁当前社区精防群体的工作与情感状态令人担忧遥因此袁为了解社区精防人员心理健康与工作满意度尧职业倦怠和离职意向的状况袁2017年5耀10月成都市社区精防人员进行了调查遥对所抽区县内的所有从事社区精防工作的专业人员进行调查遥调查工具渊1冤基本情况调查表院包括性别尧年龄尧婚姻状况尧文化程度尧工作年限尧职位尧职称尧聘用情况尧年薪等方面遥渊2冤心理健康状况调查表院采用SCL-90症状自评量表[3]曰渊3冤工作态度调查表院采用城市公立医疗机构医生工作满意度尧职业倦怠与离职意向调查问卷[4]袁采用李克特5级量表法评估遥调查方法以问卷调查的方式袁分别至所抽取社区中对调查对象发放问卷袁并进行问卷填写培训袁要求其现场匿名填写袁完成后统一回收遥本次调查实际人数163人袁所有问卷经核查质控后均有效遥统计学方法应用SPSS20.0统计软件分析袁计数资料以频数和百分率表示袁行字2检验曰计量资料以x依s表示袁行检验袁约0.05为差异有统10月袁从成都市属区县中随机抽取16个区县袁然后院2016年成都市卫生和计划生育委员会野精神卫生专项研究项目冶(201611-18)院610000成都袁成都锦欣精神病医院院黄堂辉袁E-mail:903446006@qq.com调查对象采用整群抽样法袁于2017年5~