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乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测

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乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测 YLNB 2.8

一、凯氏定氮仪常量检测法 1. 原理

样品中加入催化剂和浓硫酸,经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水,而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵,硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收,再用酸标准溶液滴定,根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。 2. 试剂

所有试剂,如未注明规格,均指分析纯;实验用水,如未注明其他要求,均指三级水。 2.1 浓硫酸 2.2 硫酸钾 2.3 硫酸铜

2.4 氢氧化钠溶液:400g/L 2.5 硼酸溶液:30g/L

2.6甲基红—溴甲酚绿混合指示剂:用体积分数为95%的乙醇,将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液,使用时按1g/L溴甲酚绿:1g/L甲基红为5:1的比例混合。 2.7 硫酸标准溶液:c (H)=0.1000±0.005mol/L

2.7.1 标准溶液的配制:取3ml浓硫酸加到15ml水中,冷

+

却后洗入1000ml容量瓶中,定容。

2.7.2 标准溶液的标定:(见GB/T601-2002)

2.7 3硫酸铵:干燥后最低含量99.9%,使用前直接将硫酸铵在102±2℃干燥至少2h,在干燥器中冷却至室温。 3. 仪器及器材

3.1 凯氏定氮仪,包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪

3.2 消化管,适用于凯氏定氮仪(3.1) 3.3 接收瓶:300ml三角瓶或烧杯 4. 方法 4.1 样品称取

4.1.1 原料奶和纯牛奶样品:称取约5g 4.1.2 乳饮料:称取约8g 4.1.3 冰淇淋:称取约5g 4.1.4 乳粉:称取约0.5g 4.2 测量 4.2.1 消化

4.2.1.1将上述样品称入消化管中,同时称取5g硫酸钾,0.5g硫酸铜,然后加入15-20ml浓硫酸,将消化管放入消化炉中,将温度旋钮设定在大约6档左右,连接好排气装置并打开开关,开始进行消化,消化30分钟或直到白烟消失后,将消化炉旋钮调节至9档,继续消化直到消化液透明。

4.2.1.2 消化至呈透明的蓝绿色后,继续消化至少1小时。在此过程中消化液必须沸腾。

注:决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定的实验室

用仪器测量一个特定

得样品所得到大量数据,一般选择一个高蛋白,高脂肪的牛奶样品,在透明后用不同的沸腾时间(1-1.5h)测定它的蛋白含量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加,逐渐趋于恒定,然后当沸腾时间更长含量反而降低。选定能得到最大蛋白质的沸腾时间。

4.2.1.3 消化结束后,消化液应是透明的。将消化管连同排气盖从消化器上移走,冷却到室温,冷却的消化液应是液体或在管底有少量的结晶体的液体。

注:大量的结晶体可能是消化过程中酸损失的结果,它能导

致检测结果偏低。为

了减少酸的损失,可降低烟吸出的速度。

4.2.1.4 消化液冷却至室温后,移走排气盖,在每个管中慢慢加约20ml水,摇动呈旋涡状使其充分混合,保证分离出的结晶体全部溶解,再冷却到室温。 4.2.2 蒸馏

把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中,在冷凝器出口的下面放置一个接收瓶,还要把连接管放到接收瓶底端,编辑蒸馏程序,设定硼酸50ml,氢氧化钠65ml,蒸馏时间3

—5min。

注:蒸馏时间是根据接收液的体积达到200ml而得到的。 4.2.3 滴定

4.2.3.1 用pH为7.00和4.00的缓冲溶液校准电位滴定仪。 4.2.3.2 设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序,将滴定终点设为4.60,并开始滴定。 4.2.3.3 记录结果。 4.3 空白试验

按照4.2.1—4.2.3所写的步骤进行空白试验,在消化管中加入0.85g蔗糖,加入蔗糖的作用是使空白在消化过程中与样品消耗等量的硫酸。 4.4 回收试验

4.4.1方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行检查,按照4.1.1—4.1.3的步骤进行。

4.4.2用0.12g硫酸铵加0.85g蔗糖进行测定。回收率应大于99%。

4.4.3用0.18g色氨酸或0.16g盐酸赖氨酸(5.9)加0.67g蔗糖进行测定。回收率应大于98%。

4.4.4在以上的两个回收试验中(4.4.2和4.4.3),低结果将说明过程失败和(或)硫酸标准溶液的浓度不准确。应检查凯氏定氮仪或重新标定硫酸标准溶液。 5. 结果计算

5.1氮含量的计算

样品中氮含量(g/100g)=其中:

V ——测定中消耗盐酸标准容液的体积,ml。 V0—— 空白试验中消耗盐酸标准容液的体积,ml。 c (H) ——硫酸标准溶液H的摩尔浓度,mol/L。 m——样品质量,g。 四舍六入的结果保留到0.01%。 5.2蛋白质含量的计算

蛋白含量的计算,用质量百分数表达,用氮含量乘以6.38即可。 5.3 回收率的计算

用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量21.19%即可。 6.允许差

同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5%。

二、半微量凯氏定氮法 1. 原理

样品中加入催化剂和浓硫酸,经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水,而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵,硫酸铵在碱性溶液

+

+

VV0CH0.014m100

中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收,再用酸标准溶液滴定,根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。 2. 试剂 2.1浓硫酸 2.2硫酸铜 2.3硫酸钾

2.4过氧化氢溶液:体积分数为30%。

2.5硼酸溶液:30g/L。取30g硼酸,溶解在1L水中。 2.6甲基红—溴甲酚绿混合指示剂:用体积分数为95%的乙醇,将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液,使用时按1g/L溴甲酚绿:1g/L甲基红为5:1的比例混合。 2.7硫酸标准溶液:c(H)为0.1mol/L。配制与标定同常量凯氏定氮仪测定法。

2.8氢氧化钠溶液,质量比为400/1000。称取400g氢氧化钠,用1000mL水溶解,待冷却后移入试剂瓶中。 3. 仪器及器材

3.1凯氏烧瓶:500ml或250ml。 3.2定氮蒸汽蒸馏器。 3.3滴定管:25ml。 3.4三角烧瓶:250ml。 4. 方法

4.1 精密称取奶粉样品2g或10~20g液体样品(约相当于

+

氮30~40mg),将样品放入凯氏烧瓶(3.1)中,加入10g硫酸钾(2.3)和1g硫酸铜(2.2),量取20ml浓硫酸(3.1),徐徐加入凯氏烧瓶中,混合。

注:1.加入样品及试剂时,避免粘附在瓶颈上。

2.加入硫酸钾的作用:提高硫酸的沸点(338℃),增进反应速度。10g硫酸钾将沸点提高到400℃,但过多的硫酸钾会造成沸点太高,生成的硫酸氢铵在513℃会分解。 3.加入硫酸铜的作用:作催化剂,使氧化作用加速。 4.2凯氏瓶口放一小漏斗,用微火加热(小心瓶内泡沫冲出而影响结果),当瓶内发泡停止,稍加大火力。同时,可分数次加入10ml过氧化氢溶液(2.4)(但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入)。当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成透明的淡绿色时继续消化0.5~1h(如凯氏烧瓶壁粘有炭化粒时,进行摇动或待瓶中的内容物冷却数分钟后,用过氧化氢溶液冲下,继续消化至呈透明为止)。然后取下并使之冷却。 4.3将澄清的消化液小心移入100ml容量瓶中,以水洗三次凯氏烧瓶,洗涤液并入上述容量瓶中,冷却后稀释至刻度并摇匀。

4.4吸取25ml消化液与定氮蒸馏器中,在冷凝器的下端放置一个盛有50ml硼酸溶液(2.5)、3滴甲基红—溴甲酚绿混合指示剂(2.6)的250ml锥形瓶,冷凝器下端的玻璃管在液面以下。将25ml氢氧化钠溶液慢慢地加入蒸馏瓶中(溶液

应呈强碱性),迅速将塞子塞好,然后通入蒸汽进行蒸馏,蒸至液面达150ml时,提出冷凝管靠在锥形瓶的瓶壁,出液口在200ml刻度线以上,继续蒸馏,蒸至液面达200ml。 注:1.蒸馏时可视蒸馏器大小,同时减少消化液和氢氧化钠的体积数,保证溶液应呈强碱性。

2.蒸馏时要注意蒸馏情况,避免瓶中的液体发泡冲出,进入接收瓶。火力太弱,蒸馏瓶内压力减低,则接收瓶内液体会倒吸,造成实验失败。

4.5用硫酸标准溶液(2.7)滴定至溶液出现酒红色为止,记录所用硫酸标准溶液的体积。同时进行空白试验,并在结果中加以校正。 5. 结果计算

样品中蛋白质含量(g/100g)=

VV0CH0.014F25m100100

式中:v—滴定时消耗硫酸标准溶液的体积,ml;

v0—空白试验消耗硫酸标准溶液的体积,ml; c(H)—硫酸标准溶液中H的浓度,mol/l; m—样品的质量,g;

0.014—氮原子的摩尔质量,kg/mol;

F—氮换算为蛋白质的系数。乳粉为6.38,纯谷物类(配方)食品为5.90,含乳婴幼儿谷物(配方)食品为6.25。

注:空白试验仅不加入样品,操作步骤与样品相同。

+

+

6. 允许差

同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5%。 7. 注意事项

7.1 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。

7.2 样品中脂肪或糖含量较高时,消化过程中易产生大量的泡沫,可加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂,并同时注意控制热源强度。

7.3 有机物完全分解,消化液呈兰色或浅绿色,但含铁量多时,呈较深绿色。 7.4 蒸馏装置不能漏气。

7.5 蒸馏前若加碱量不足,消化液呈兰色,不生成氢氧化铜沉淀。此时需要再增加氢氧化钠的用量。

7.6 硼酸吸收液的温度不能超过40℃,否则对氨的吸收作用减弱而造成损失。

7.7 混合指示剂临用时混合,它在碱性溶液中呈绿色,中性溶液中呈灰色,酸性溶液中呈红色。因用硫酸滴定硼酸铵溶液,生成硫酸铵应为强酸弱碱盐,所以溶液呈酸性,指示剂应显红色。

7.8蛋白测定中,在催化剂中加入二氧化钛,消化速度将会更快。能使难以氨化的组分快速氨化。蒸馏时可加入锌粒,

其作用相当于沸石,用量如绿豆大即可。

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