_葡聚糖酶的分离纯化和特性研究

菌 物 系 统 20-ÆϾÛÌÇø´ÖøҺͨ¹ý±¥ºÍÁòËá麟Áµí±È»îÌá¸ß14.60±¶,»îÁ¦»ØÊÕ6.62%×îÊÊζȺpÍH·Ö±ðΪ60 Cu２＋ 关键词纯化Q936; Q939.56 文献标识码1007-351502-0178-0183 Ｍｇ２＋ÔÚpHµÍÓÚ5.0ʱø½ÏÎȶ,¨Ã¸µÄÈÈÎȶ¨ÐÔÔ60ÚＣａ２＋　ÊÇÒÔ»ìº(Ï11977) 它主要分解大麦中的酶1989-葡聚糖酶主要由植物(大麦1990由于大麦中１９７２葡聚糖的酶系在啤酒和饲料生产过程中添加Ａｌｍｉｒａｌｌ　et al.行了广泛的研究1999本试验的目的是纯化里氏木霉1993小麦1996Ｈｅｎｒｙ当它用作饲料原料时降低饲料转化率　一些微生物)产生4)-所以又叫地衣多糖芽孢杆菌和瘤胃中的1997啤酒过滤速度减慢-1,3-1,4--葡聚糖酶(EC.3.2.1.73)是一类分解会降低麦汁分离速度和麦汁浸出量阻止肠道消化液与食糜充分混合１９９１刘妙莲等¹úÍâ´Ó60年代开始对其进而对里氏木霉β-葡聚糖酶研究较少并对其酶学性质进行研究Sephadex G-25, Sephadex G-100和DEAE Sephadex A-50 由Pharmacia 提供 ∗*高等学校骨干教师资助计划资助30000118浙江省自然科学基金收原稿日期收修改稿日期和浙江省教委项目资助 2期 李卫芬等使之分泌酶蛋白角瓶装　５０　ｇ灭菌　３０　ｍｉｎ３２　５００　ｍｌ　三 È¡200 g 发酵产物悬浮于 取上清液ÉÏÇåÒºÖØÐÂÓÃ60%饱和硫酸铵沉淀１．４酶纯化步骤　１．４．１硫酸铵粗提2000 ml 无离子水中弃上清 pH 5.3pH 5.3º¬µ°°×ÖʵÄ×é·ÖºÏ²¢ÉÏÊöº¬µ°°×ÖʵÄ×é·Ö３　ｃｍ）　柱ÊÕ¼¯º¬Ã¸×é·ÖºÏ²¢ÉÏÊöº¬Ã¸×é·Ö300 mmol/L NaCl 的 50 mmol/L 醋酸钠缓冲液分析β-葡聚糖酶活性和蛋白质浓度１．５　蛋白质的测定　　以牛血清白蛋白为标准³ÆÈ¡1.0g´óÂópH5.3１００　ｍｌ称取１０．０ｇ　３，５－二硝基水杨酸适当加热１．６．３ 测定步骤1.0%的光度计)预热5 min·Ðˮԡ5 min -葡聚糖酶活在试管中加入１．８　ｍｌ　１．０％的ｌ　１．７．２热稳定性酶活分别用不同ｐＨ（3.0~7.0）　的０．０５　ｍｏｌ／Ｌ醋檬酸钠缓冲液配制成１．０％的葡聚糖底物１．７．４　ｐＨ稳定性　　水浴条件下处理酶液１．０ｈ水浴条件下反应１０．０　ｍｉｎ　 然后按常规条件测定水浴中保温３０　ｍｉｎ预热５ｍｉｎ参照Miller方法l １９５９在试管中加入1.8 ml 准确反应10.0 minÔÚ540nm 处比色(721型分光ø»îÁ¦µ¥Î»搅拌溶解加热直至BradfordÏȼÓÈë1.0 ml ÒÒ´¼定容至并浓缩和含用含20 mmol/L NaCl 的50 mmol/L 醋酸钠缓冲液进行线形梯度洗脱 并浓缩洗脱速度为12 ml h-1, 每管收集2 ml 3 cm)进行脱盐-1Ï´ÍÑËÙ¶ÈÎ60 ml hª, 每管收集3 ml则实验操作在4恒温浸提 2 h然后5000g离心15 min１．４．２ 过 Sephadex G-25柱脱盐ÊÕ¼¯´ÓÆÏÌÑÌDZê×¼ÇúÏßÇóµÃÆÏÌÑÌǺ¬Á¿180 菌 物 系 统 20卷 测定酶活在试管中加入1.8 ml 1.0%的l 含50.0 mmol/L化合物的酶液５０ MgSO4以蒸馏水作对照 ZnSO4 FeCl3-葡聚糖酶活的影响 CoCl2和 KCl预热5 minÉÏSephadex G-25 柱脱盐合并含蛋白质的组分并浓缩有很高的β-葡聚糖酶活性和蛋白质含量 取上述4.0 ml含酶样品结果列于图1糖酶活性并具有很高的酶活分段收集其洗脱液·åI 再经 DEAE-Sephadex A-50 柱分离β-葡聚糖酶相对于粗酶液纯化了14.60倍酶的回收率为 6.62%(见表1)¾ßÓÐβ-葡聚用硫酸铵沉淀浓缩发现44-55 管具2期 李卫芬等范围内酶活力较高反应温度为６０超过６５时相对酶活仅为１７．０３％和５０在６０力损失达８１．２７％残余酶活为７８．３０％其最适时酶活其最适ｐＨ为５．０降低食糜黏度如胃酸４）在 pH低于5.0时时的残余酶活分别为71.79% ２．６　金属离子对酶活的影响　由表2可知, Cu2+, Mg2+ Ïà¶Ôø»îÔÚ90%以上Co2+的激活作用最大 Fe3+和K+对 β-葡聚糖酶有抑制作用Ｃａ2+ 　ÆäÖÐ其次为Cu2+, 其相对酶活力分别为40.70%和70.11%.-葡聚糖酶相对较稳定４．０和5.0当ｐＨ为３．０时如果ｐＨ超过５．０，　酶活力下降较大，　在ｐＨ　６．０和７．０时的相对酶活分别为４４．４４％和１３．５０％（图3 结论 Sephadex G-100 柱层析和DEAE-Sephadex A-50 柱层析分离纯化后,相对于粗酶液纯化了14.60倍182 菌 物 系 统 20卷 酶的回收率为 6.62%ÈÈÎȶ¨ÐÔÔ6Ú0 Cu2+Mg2+和5.0 Ca2+ 　表２　　化合物对葡聚糖酶活的影响　Table 2 Effect of compound on β-glucanase activity 化合物Compound 相对酶活Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　１００　114.71 92.05 70.11 108.45 化合物Compound 相对酶活Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　90.92 47.70 114.94 137.24 89.20 Ｃｏｎｔｒｏｌ　CaCl2 MgSO4 Cu SO4 ZnSO4 ＭｎＳＯ4 FeCl3 FeSO4 CoCl2 KCl 　　［参　　考　　文　　献］　李卫芬, 余东游, 孙建义, 1999.刘妙莲, 林宇野, 王薇青,　1989.-葡聚糖降解研究.中国酿造, 5: 23 ~25 Almirall M, Francesh M , Perez Vendrell A M, 1995.The difference in intestinal viscosity produced by barley and6: 97 ~101 2期 李卫芬等－ｇｌｕｃａｎｓ　ｏｆ　ｂａｒｌｅｙ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅCarbohydr Res, 57:15 ~23 Flint H J, Mcpherson E C, Bisset J, 1989. Molecular cloning of genes from Ruminococcus flavefaciens encoding xylanase and glucan endohydrolases. Mol Gen-Genet, 224:437 ~449 Sait M E, Shella I M, Harry J H,1997. Isolation and overexpression of a gene encoding an extracellular -glucan . J Inst Brew, 78: 79 ~186 Takashi A, Hanae K , Naoto S , 1996. Purification and partial characterization of an endo--1,3-1,4-