GDNF基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗大鼠脑出血

泸州医学院学报　３２６　２０１１年　第３４卷　第４期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｕｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｖｏ１．３４　Ｎｏ．４　２０１　１　ＧＤＮＦ基因修饰的骨髓基质干细胞移植　治疗大鼠脑出血　木　邓莉，涂江义　，郭侃，高小青，杨朝鲜　（泸州医学院：神经生物研究室；　解剖学教研室，四川泸州６４６０００）　摘要目的：探讨移植胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）基因修饰的骨髓基质干细胞（ＢＭＳＣｓ）是否比单纯ＢＭＳＣｓ移植　对脑出血有更好的保护作用。方法：采用脑立体定位方法注射肝素和胶原酶制作脑出血模型，第３ｄ分别移植ＢＭＳＣｓ、ＧＤＮＦ／　ＢＭＳＣｓ以及生理盐水，分别在１ｗ和２ｗ处死大鼠，免疫组织化学染色观察脑源性神经营养因子和神经生长因子１３在脑出血周　边区的表达。结果：各时间点ＧＤＮＦ／ＢＭＳＣｓ组的ＢＤＮＦ和ＮＧＦ—Ｂ免疫阳性产物比ＢＭＳＣｓ与生理盐水组显著增加。结论：　ＧＤＮＦ基因修饰的ＢＭＳＣｓ比ＢＭＳＣｓ对大鼠脑出血有更好的保护作用。　关键词骨髓基质干细胞；脑出血；移植；基因治疗；神经营养因子　中图分类号Ｒ３３８　文献标识码Ａ　文章编号１０００—２６６９（２０１　１）４—０３２６—０４　ＧＲＡＦＴＩＮＧ　ｏＦ　ＧＤＮＦ　ＧＥＮＥ—ＭｏＤＩＦＩＥＤ　ＢｏＮＥ　ＭＡＲＲｏＷ　ＳＴＲｏＭＡＬ　ＣＥＬＬＳ　Ｔｏ　ＴＲＥＡＴ　ＩＮＴＲＡＣＥＲＥＢＲＡＬ　ＨＥＭｏＲＲＨＡＧＥ　ＩＮ　ＲＡＴＳ　Ｄｅｎｇ　Ｌｉ，ｅｔ　ａｌ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｕｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＭＳＣｓ——ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ｂｙ　ＧＤＮＦ　ｇｅｎｅ　ｈａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｈａｎ　ｎａｔｉｖｅ　ＢＭＳＣｓ　ｏｎ　ｓｔｒｏｋｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ　ｈｅｐａｒｉｎ　ａｎｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｉｎ　ｃａｕｄａｔｅ　ｐｕｔａｍｅｎ　ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃａｌｌｙ，ｔｈｅｎ　ｗｅｒｅ　ｇｒａｆｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＤＮＨＢＭＳＣｓ、ＢＭＳＣｓ　ａｎｄ　ｓａｌｉｎｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　３　ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｅｃｕｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｌｗ　ａｎｄ　２ｗ．　Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｂｒａｉｎ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）ａｎｄ　ｒｌｅｒｙｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ—ｂｅｔａ（ＮＧＦ—Ｂ）ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｒｇｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　ｆｏｃｕｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｂｏｔｈ　ＢＤＮＦ—ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ＮＧＦ－１３一ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｎ　ＧＤＮＦ／ＢＭＳＣｓ　ｇｒｏｕｐ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ＢＭＳＣｓ　ｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｓａｌｉｇｎｅ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｐｒｅｓｅｎｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ　ｔｈａｔ　ｇｒａｆｔｉｎｇ　ＢＭＳＣｓ　ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ｂｙ　ＧＤＮＦ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｓｔｒｏｋｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ；Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ；Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ；Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　脑出血（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ，ＩＣＨ）是脑卒　ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）具有以下特征：①可自我复制和更新。　中中最严重的类型之一，其致残率、致死率高，给社　会、家庭和个人造成沉重的负担。至今为止，无有效　的治疗措施以重建受损的脑组织和促进神经功能恢　复。近几年，细胞移植对中枢神经系统损伤修复进行　了探讨。其中骨髓基质干细胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　四川省卫生厅课题（２００６Ｊ１３—００５—１）　（１００２２４）；四川省科技厅课题　产生与自己相同的子细胞，维持稳定的细胞储备；②　处于较原始的未分化状态，无相应成熟的特异性标　志；③具有多向分化潜能，具有演变成不同成熟细胞　类型的能力【”。　目前神经营养因子已经被证明在神经再生、神　经营养或神经保护中有多重作用。胶质细胞源性营　养因子（ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ＇　作者简介：邓莉（１９７６一），女，硕士，讲师　ＧＤＮＦ）对多种神经损伤具有保护作用［２Ｉ３Ｊ。干细胞移　第４期邓莉等：ＧＤＮＦ基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗大鼠脑出血　３２７　植可以促进卒中后的功能恢复。ＢＭＳＣｓ具有来源丰　富、采集方便、扩增迅速、可自体移植等诸多优点，成　为理想的种子细胞　。本研究采用脑立体定位仪向　ＳＤ大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素制备脑出血模　型，将大鼠ＧＤＮＦ修饰的ＢＭＳＣｓ立体定位植入大鼠　脑出血模型脑内，运用免疫组织化学法观察脑源性　神经营养因子（ｂｒａｉｎ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ，　ＢＤＮＦ）和神经生长因子一Ｂ（ｎｅｖｅｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ—ｂｅｔａ，　ＮＧＦ—Ｂ）在脑出血周边的表达变化，探讨ＢＭＳＣｓ移　植于出血脑内是否对神经元的数量产生影响。　１材料和方法　１．１材料　ＳＤ成年大鼠购自第三军医大学动物实验中心；　ＤＭＥＭ培养基（美国Ｇｉｂｃｏ），多聚赖氨酸购自Ｓｉｇｍａ　公司：免疫组织化学ＳＡＢＣ显色试剂盒、兔多克隆　ＢＤＮＦ和ＮＧＦ—Ｂ抗体购自中杉公司；ＤＡＢ显色（博　士德公司）；脑立体定位仪购自美国（Ａｎｇｅｌ　ｒｗｏＴＭ　Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　ｗ／Ｒａｔ　Ａｔａｌｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔ：＃４６４６０１，　ＵＳＡ）。　１．２方法　１＿２＿１构建大鼠ＧＤＮＦ基因的ｐＡｄＥａｓｙ—ｌ—ｐＡｄＴｒａｃｋ　ＣＭＶ重组体　本科室已构建大鼠ＧＤＮＦ基因的腺病毒载体重　组体（ｐＡｄＥａｓｙ一１一ｐＡｄＴｒａｃｋ　ＣＭＶ—ＧＤＮＦ）。腺病毒重　组质粒含有报告基因绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）。ｐＡｄＥａｓｙ－１－ｐＡｄＴｒａｃｋ　ＣＭＶ—ＧＤＮＦ病　毒滴度是ｌｘｌＯｇＰＦＵ／ｍｌ，一８０℃保存。　１．２．２　ＢＭＳＣｓ的分离与培养并转染　大鼠处死后在无菌条件下分离双侧的股骨和胫　骨，剪掉骨头两端，露出骨髓腔，用无血清的ＤＭＥＭ　培养液冲洗骨髓腔，反复２次或３次，以１０００　ｒ／ｍｉｎ　离心５ｍｉｎ。离心后弃上清，用含１００　ｍｌ／Ｌ胎牛血清　的ＤＭＥＭ培养液重悬沉淀的细胞，接种于培养瓶　中。５％ＣＯ　湿饱和条件下，３７℃恒温孵箱培养２４　ｈ　后全量换液，后每３ｄ全量换液１次，细胞基本铺满　瓶壁后，以０．２５％胰酶消化传代。　１．２．３　ＧＤＮＦ基因重组腺病毒转染ＢＭＳＣｓ　选取第３代ＢＭＳＣｓ接种到６孔板上，在细胞生　长到９０％融合时，依据ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００试剂说　明书转染ＢＭＳＣｓ。然后离心细胞悬液，收集ＧＤＮＦ／　ＢＭＳＣｓ细胞以供移植用。　１．２．４制备大鼠脑出血模型　成年ＳＤ雄性大鼠按照杨朝鲜等［７１制备大鼠脑　出血模型的方法，参考大鼠脑图谱｛８１，选择前囟前　０．２ｍｍ、中线右侧３．０ｍｍ、深度６．５０ｍｍ为注射点（即　尾壳核位置）；注入１ｔｘｌ肝素和２１ｘｌ胶原酶，以０．３　ｐＭｍｉｎ速度推入脑内，留针５ｒａｉｎ。大鼠清醒后，按照　Ｌｏｎｇａ　５分制神经病学评分标准对大鼠神经功能进　行评分。１～３分视为模型制作成功。　１．２．５　ＢＭＳＣｓ的移植　将ＢＭＳＣｓ细胞悬液调整密度为５ｘ１０　／ｔｘｌ。在脑　出血第３ｄ．大鼠随机分为ＧＤＮＦ／ＢＭＳＣｓ组、ＢＭＳＣｓ　组和生理盐水组３组，每组１２只。用ｌ％的戊巴比妥　钠麻醉大鼠将其固定在脑立体定位仪上，从原针孔　垂直进针６．０ｒａｍ：将２０ｔｘｌ　ＧＤＮＦ／ＢＭＳＣｓ、ＢＭＳＣｓ用　微量注射器按照２１ｘｌ／ｍｉｎ的速度匀速注射；对照组　用同样方法注射生理盐水２０ｐＡ。　１．２．６免疫组织化学显色　在各时间点，用戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，　４％多聚甲醛灌注固定后取脑。石蜡包埋。以针孔为　中心连续冠状切片（片厚５ｔｘｍ）用于免疫组织化学染　色。切片脱蜡至水，新配制的３％Ｈ２０　室温处理　２０ｍｉｎ以灭活内源性过氧化物酶；抗原微波修复；　１０％山羊血清３７￣Ｃ孵育４０ｍｉｎ，吸干不洗；兔多克隆　抗体ＢＤＮＦ、ＮＧＦ—Ｂ（１：１００），４℃过夜；生物素化羊抗　兔ＩｇＧ（１：１００），３７℃，２ｈ；ＨＲＰ—Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　３７℃，２ｈ。　以上各步骤结束时用０．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液洗３　次。孵育在湿盒内进行。ＤＡＢ显色５—１０ｍｉｎ，细胞胞　浆呈棕黄色或黄褐色者为阳性细胞。苏木素轻度复　染，脱水、透明、封片。阴性对照除不加一抗外，其余　处理相同。每只鼠选３张切片，每张切片光镜下在出　血灶周边区随机取５个视野（ｘ４００），进行阳性细胞　计数。　１．３统计学方法　所有数据用　±ｓ表示，组内比较用单因素方差　分析，组间两两比较，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２结　果　ＢＤＮＦ免疫反应阳性产物为棕黄色点状或颗粒　状沉淀．主要分布于额顶皮质锥体细胞层、第Ｖ层明　显：背侧丘脑：下丘脑及海马的神经元胞浆及突起。　对ＢＤＮＦ阳性细胞计数分析表明：在出血灶周边，　ＢＤＮＦ的阳性细胞数ＧＤＮＦ／ＢＭＳＣｓ组及ＢＭＳＣｓ组　均高于生理盐水组。差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。　１ｗ、２ｗ时ＧＤＮＦ／ＢＭＳＣｓ组ＢＤＮＦ的阳性细胞数比　ＢＭＳＣｓ组显著增加（Ｐ＜０．０５）（见表１，图１）　第４期　邓莉等：ＧＤＮＦ基因修饰的骨髓基质干细胞移植治疗大鼠脑出血　３２９　３讨论　文献显示，细胞移植对脑出血脑损伤有保护作　用［Ⅷ。啮齿类实质干细胞或人类骨髓基质干细胞移　植可改善脑缺血模型中的神经功能缺损ｌｌ１，１２］。ＧＤＮＦ　是目前发现的特异性最强的多巴胺能神经营养因　子。同时又是一种运动神经元营养因子。其在组织　中的含量少，外源性ＧＤＮＦ不能直接通过血脑屏障，　应用上有一定的局限性。而基因克隆是基因工程中　获得外源基因的有效途径，本实验用转染了ＧＤＮＦ　的ＢＭＳＣｓ移植治疗尾壳核出血后大鼠神经功能有　明显改善。　神经营养因子不仅在中枢神经系统发育过程中　对神经元的生存、分化、生长和维持神经元正常的生　理功能等方面起重要作用，还具有抗损伤性刺激，　促进神经元的再生，保护缺血缺氧的神经元，维持　神经元功能和再生修复及防止神经元细胞进行性病　变，刺激诱导轴突再生以及促进神经通路、抑制神　经细胞凋亡的重要作用。本实验ＧＤＮＦ／ＢＭＳＣｓ组及　ＢＭＳＣｓ组ＢＤＮＦ阳性细胞数均高于生理盐水组。　ＮＧＦ一１３能使神经元前体细胞增殖，对胆碱能神　经元、单胺类神经元、肽能神经元、交感神经元均具　有支持存活作用，可增加神经递质合成，阻止神经元　细胞程序性死亡。本实验结果证明：ＮＧＦ—Ｂ的阳性　细胞数ＧＤＮＦ／ＢＭＳＣｓ组均高于ＢＭＳＣｓ组和生理盐　水组。提示这些神经生长因子在大脑皮质运动区可　能通过骨髓基质干细胞自分泌或旁分泌模式发挥重　要生物学作用。　转基因ＮＳＣｓ移植后可以分泌ＧＤＮＦ并促进脑　外伤大鼠神经功能的恢复＿１３］。本室其他研究者在大　鼠脑缺血再灌注３ｄ后立体定位移植ＧＤＮＦ基因修　饰的ＮＳＣｓ到侧脑室，结果证明ＧＤＮＦ基因修饰的　ＮＳＣｓ比ＮＳＣｓ对大鼠脑卒中有更好的神经保护作　用『１４１。有研究表明：外源性的ＧＤＮＦ和宿主自身的神　经营养因子可以阻止神经元的凋亡并减轻脑梗死体　积　１。本实验结果表明移植转染了ＧＤＮＦ基因的　ＢＭＳＣｓ较单一ＢＭＳＣｓ能增强脑出血周边神经营养　因子的表达，为基因治疗脑出血打下基础。　参考文献　１．　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｓＪ，Ｓｈａｈ　ＮＭ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＤＪ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｅｃｈａ—　ｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９７；８８（３）：２８７　２．　Ｚｈａｎｇ　ＷＲ，Ｓａｔｏ　Ｋ，１ｗａｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔｉｍｅ　ｗｉｎ—　ｄｏｗ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ——ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＧＤＮＦ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｍｉｄｇｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｙ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ　Ｕ１．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ，２００２；９４７（１）：１４０　３．　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ，Ａｈｌｅｎｉｕｓ　Ｈ，Ｔｈｏｒｅｄ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｌａ　ｉｎ—　ｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｈａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ——ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏ—　ｍｏｔｅｓ　ｓｔｒｉａｔａｌ　ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，　２００６；３７（９）：２３６１　４．　Ｃｈｅｎ　Ｊ，Ｚｈａｎｇ　ＺＧ，Ｌｉ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｎｇａｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｂｏｕｎｄａｒｙ　ｚｏｎｅ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ｒａｔｓ　Ｕ］．Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，２００３；９２（６）：６９２　５．　Ｓｈｙｕ　ＷＣ，Ｌｅｅ　ＹＪ，Ｉ　Ｊｉｕ　ＤＤ，ｅｔ　ａ１．Ｈｏｍｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ，ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｓｔｒｏｋｅ　Ｕ］．Ｆｒｏｎｔ　Ｂｉｏｓｃｉ，２００６；１１（１）：８９９　６．Ｄｅｎｇ　ＹＢ，Ｌｉｕ　ＸＧ，Ｌｉｕ　ＺＧ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＭ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｉｎｊｕｒｅｄ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｅｌｉｃｉｔｓ　ｄｅ　ｎｏｖｏ　ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｍａｙ　ｉｎ　ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙｓ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２００６；８（３）：２１０　７．　杨朝鲜，周玲，袁琼兰，等．大鼠脑出血后神经行为学和脑　组织病理学改变的特点ＵＪ＿中风与神经疾病杂志．２００７；　２４：６０１　８．Ｐａｘｉｎｏｓ　Ｇ，Ｗａｔｓｏｎ　Ｃ．Ｔｈｅ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｉｎ　ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ　ｃｏｏｒｄｉ～　ｎａｔｅｓ［Ｍ］，２ｎｄｅｄ．Ｓｙｄｎｅｙ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ，１９８６；２７～３１　９．Ｌｏｎｇａ　ＥＺ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ　ＰＲ，Ｃａｒｌｓｏｎ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｅｌ　ｉｍｄｇｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｙ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｃｒａｉｎｅｃｔｏｍｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｓｔｏｋｅ，１９８９；２０：８４　１Ｏ．　阮成钧，张化彪，冯伟生，等．细胞移植对脑出血脑损伤的　保护作用Ｕ］．中国组织工程研究与临床康复，２００８；１２　（３６）：７５５１　１　１．　Ｃｈｅｎ　Ｊ，Ｌｉ　Ｙ．Ｃａｓｐａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｉｔｏｎ　ｂｙ　ｚ—ＶＡＤ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｇｒａｆｔｅｄ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｆｕｎｃ－　ｔｉｏｎａｌ　ｏｕｔｃｏｍｅ　ａｆｔｅｒ　ＭＣＡＯ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ１．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｌ　ｓｃｉ，　２００２；１９９（１）：１７　ｌ２．Ｌｉ　Ｙ，Ｃｈｅｎ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　ＸＧ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　ｍａ￣ｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ｒａｔ：ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ［ｊ］．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００２；５９（４）：５１４　１３．　王飞，潘庆刚，邓东风，等．胶质细胞源性神经营养因子　基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠脑损伤［仃．中华创　伤杂志，２Ｏ０７；２３（１２）：８９４　１４　陈波，高小青，杨朝鲜，等．移植ＧＤＮＦ基因修饰的神经　干细胞对大鼠脑卒中的神经保护作用Ｕ】．解剖学杂志　２００９；３２（３）：２８６　１５．Ｈａｒｔｉｎｇ　ＭＴ，Ｓｌｏａｎ　ＬＥＪｉｍｅｎｅｚ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｂａｃｕｔｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅａｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｔｒａｕｍａｔｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｅｒｙＵ】．Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｒｅｓ，　２００９；１５３（２）：１８８　（２０１　ｌ一０３～２５收稿）