猪圆环病毒2型与猪轮状病毒混合感染的防控

※种植与养殖　农业与技术　２ｏｉ７，ＶｏＬ３７，Ｎｏ．０１　１３５　猪圆环病毒２型与猪轮状病毒混合感染的防控　熊文海　，　凌万旭　颜洪奎　何锦　（１．云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明６５０２０１；２．昆明伟牧得生物科技有限公司，云南昆明６５０２０４　３．风庆动物疫病预防控制中心，云南风庆６７５９００）　摘　要：云南省某养殖场饲养母猪２６０多头，所产仔猪近期有２０％左右发病，发病时间已达２个多月，部分仔猪出生　第２天发病，主要症状表现为腹泻，拉黄色粪便，同养殖场肥猪、保育猪均表现正常。为诊断仔猪患病情况，为综合　防控提供支持，对该场送检的３头病仔猪进行病理剖检，采集组织用ＰＣＲ技术进行病原检测。检测结果为１号猪猪圆　环病毒２型抗原检测呈阳性，３头仔猪猪轮状病毒抗原检测呈阳性，说明该生猪养殖场发生了猪圆环病毒２型与猪轮　状病毒的混合感染。通过对该养殖场母猪、仔猪进行免疫接种，发病仔猪隔离治疗、加强养殖场饲养管理等措施，最　终控制了猪圆环痛毒２型与猪轮状病毒混合感染的疫情。　关键词：仔猪腹泻；猪圆环病毒２型；猪轮状病毒；混合感染；ＰＣＲ诊断　中图分类号：￥８２８　文献标识码：Ａ　Ｄ０Ｉ：１０．１１９７４／ｎｙｙｊｓ．２０１７０１３２０６１　前言　猪轮状病毒（ＲＶ）属于呼肠孤病毒科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）　碍、先天性震颤及肠炎等。该病的主要病理变化为：贫　血、黄疸、淋巴结异常肿胀，内脏和外周淋巴结肿大到　正常体积的３￣４倍，切面为均匀的白色，肺部有灰褐色　轮状病毒属（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）双股ＲＮＡ病毒。猪轮状病毒病　炎症和肿胀，肝脏发暗、萎缩、肾脏水肿、脾脏轻度肿大，　为急性肠道传染病，临床上表现为哺乳仔猪和断奶前、　后仔猪呕吐、腹泻、脱水体重减轻为特征的急性肠道传　染病…。该病在全世界各地猪场均有发生，多发生于晚秋、　冬季和早春，呈地方性流行，轮状病毒感染是断奶前后　仔猪腹泻的重要原因　，初期病猪表现为沉郁、食欲不　振和不愿活动，之后不久会发生严重腹泻，粪便呈水样　３０％　。本病症状的轻重受发病猪日龄、环境条件以及　免疫状况等的影响，一周龄以内的仔猪受母源抗体的保　护，不易发病，但如果缺乏有效的母源抗体保护，１０日　龄内的仔猪发病症状严重，严重时病死率可达１００％。　病猪剖检时可见猪小肠胀气，肠内容物呈棕黄色水样，　肠壁菲薄呈半透明状，有时可见小肠弥漫性出血，胃中　有未消化凝乳块。　胰、小肠、结肠也常有肿大及坏死病变　。猪圆环病毒　病为免疫抑制性疾病，常引发其他病原混合感染和继发　感染Ｉ６］。如猪圆环病毒２型与猪瘟混合感染、猪圆环病　毒２型与猪附红细胞体混合感染等，而猪圆环病毒２型　与猪轮状病混合感染却不常见。　云南某生猪养殖场共养殖母猪２６０多头，所产仔猪　死亡率不高，仔猪从出生的第２天发病，主要症状表现　腹泻，拉黄色粪便，仔猪断奶后病情有所好转。同养殖　或糊状，黄白色或暗黑色，严重脱水、消瘦、体重减轻　近期有２０％左右发病，发病时问已达２个多月，发病猪　场大猪、保育猪均表现正常。　２０１６年９月１日，云南省某生猪养殖场把３头腹泻　仔猪送往云南农业大学做检测，根据腹泻仔猪临床症状、　病理解剖结果、养殖场流行病学调查和实验室ＰＣＲ检测　结果，最终确诊该养殖场哺乳仔猪腹泻由猪圆环病毒２　猪圆环病毒病（ＰＶＣＤ）是近年来发现的一种较难　型与猪轮状病毒混合感染引发，根据诊断结果养殖场立　控制的病毒性传染病，该病由猪圆环病毒２型（ＰＣＶ－２）　即采取防控措施，７ｄ后病情被控制，１　４ｄ后疫情完全平息，　引发。该病不同年龄阶段的猪均可感染，该病主要侵害　现报告如下。　哺乳仔猪和育肥猪及怀孕母猪。临床表现为猪高热、呼　吸困难、咳嗽、肠炎，母猪表现为繁殖障碍等　。其引　起的疫病包括猪断奶后多系统衰竭综合征（ＰＭＷＳ），　ｌ　材料与方法　１．１　材料的来源　增生性坏死性肺炎（ＰＮＰ）、猪皮炎与肾病综合征　（ＰＤＮＳ）、猪呼吸系统疾病综合征（ＰＲＤＣ）、繁殖障　１．１。１　病猪病料　来源于云南省某生猪养殖场送检３头腹泻仔猪，由　１３６　２０１　７，ＶｏＺ３Ｚ，Ｎｏ．０１　农业与技术　※种植与养殖　实验室解剖并无菌采取仔猪的肺脏、肾脏、肝脏，小肠　ＰＣＲ扩增体系为：Ｍｉｘ（含１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ，ｄＮＴＰｓ，　ＴｒａｎｓＴａｑ酶）１２．５　ｕＬ，ｄＨ２０　１０．５　ｕＬ，上下游引物各　０．５　ｕＬ，ＤＮＡ　１　ｕＬ，总反应体系为２５　ｕＬ。ＰＲＲＳＶ扩增　内容物。３头仔猪组织样品分别编号１号、２号、３号。　１．１．２　试剂　ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ购自大连宝生物生物技术　有限公司；Ｂｉｏｔｅｋｅ细胞／组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒　购至北京百泰克生物技术有限公司；ＲＩ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ、　２　ｘ　ＥＳ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ、２×Ｔｒａｎｓ　Ｔａｑ　ＨｉＦｉＰＣＲ　Ｓｕｐｅｒ　Ｍｉｘ　反应条件为：９４℃３　ｍｉｎ；９４℃１　ｍｉｎ，６５℃１　ｍｉｎ，　７２℃１　ｍｉｎ，４０个循环；７２℃５　ｒａｉｎ。ＰＣＶ、ＲＶ、　ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ扩增反应条件同ＰＲＲＳＶ。　ＣＳＦＶ第１轮扩增反应条件为：９４℃５ｒａｉｎ；　９４℃３０ｓｅｃ，５３　ｏＣ　４５ｓｅｃ，７２℃５０ｓｅｃ，３４个循环；７２℃　购自北京全式金生物技术有限公司；异丙醇、７５％乙醇、　琼脂粉、ＴＡＥ缓冲液、双蒸水、氯仿等由实验室提供。　１．２　临床观察及病理解剖　对送检的３头腹泻仔猪进行临床症状观察，并向养　殖场户主详细了解发病情况，实验室剖检３头腹泻仔猪，　详细记录剖检变化并取材保存。　１＿３　ＰＣＲ检测　１＿３．１　引物　本次检测７个病原特异性引物均由云南农业大学　动科院动物传染病实验室设计，特异性引物片段长度　为：猪瘟病毒２３４ｂｐ、猪蓝耳病毒３３０ｂｐ、猪圆环病　毒７０１ｂｐ、猪伪狂犬病毒５００ｂｐ、猪流行性腹泻病毒　为４７１ｂｐ、猪传染性胃肠炎病毒４３９ｂｐ、猪轮状病毒　３７４ｂｐ。引物由上海生工（生物）有限公司合成。　１．３．２　样品ＤＮＡ，ＲＮＡ提取　用Ｔｒｉｚｏｌ法提取样品组织中的总ＲＮＡ，实验过程严　格按照操作说明进行；病毒ＤＮＡ的提取按照百泰克生　物技术有限公司的ＤＮＡ快速提取试剂盒提取，实验过　程严格按照操作说明进行。　１．３．３　ＰＣＲ扩增目的片段　提取的ＲＮＡ利用北京全式金公司的反转录试剂盒　（货号ＡＥ３０１—０２）反转录得到ｃＤＮＡ，并以ｃＤＮＡ为模　板，利用特异性引物分别进行猪瘟、蓝耳　猪流行性腹泻、　传染性胃肠炎及轮状病毒ＰＣＲ扩增。提取的ＤＮＡ利用　北京全式金公司的试剂盒（货号ＡＳ１３１—０２），利用特异　性引物进行猪圆环、猪伪狂犬病毒ＰＣＲ扩增。　１．３．４　目的基因片段ＰＣＲ扩增　将上述提取出来的样品ＲＮＡ￣ＬＩ用特异性引物对其进　行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，反转录体系如下２×ＥＳＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ（含　１０×ＲＴ　Ｂｕｆｆｅｒ，ｄＮＴＰｓ）５ｕＬ，ＥａｓｙＳｃｒｉｐｔＴＭ　１Ｉ　ＲＴ／ＲＩ　Ｅｍｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（含Ｒｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，反转录酶）０．５ｕＬ，下　游引物ｌｕＬ，模板ＲＮＡ　３．５ｕＬ，反应体系为１０ｕＬ。将配　制好的体系置于４２￣Ｃ反应３０ｒａｉｎ，之后８５￣Ｃ反应５ｍｉｎ。　反转录产物置于４℃保存备用。将上述反转录产物及提　取出来的样品ＤＮＡ利用特异性引物对其进行ＰＣＲ扩增，　５ｍｉｎ。将所得到的第１轮产物稀释３００倍后，进行第２　轮扩增，反应条件为：９４￣Ｃ　５　ａｒｉｎ；９４￣Ｃ　４０ｓｅｃ，５６Ｖ　４０ｓｅｃ，７２￣Ｃ　４０ｓｅｃ，３４个循环；７２￣Ｃ　５　ｍｉｎ。　取上述ＰＣＲ扩增产物ｌＯ　ｕＬ配制成体系后加样到　１．５％琼脂糖凝胶（含０．２％ＥＢ）孔中，并在１２０Ｖ电压　下进行３０ｒｎｉｎ的电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并　拍照。　１．４　治疗方法　根据诊断结果采取特异性防控措施和综合性防控措　施相结合的方法。方法如下。　１．４．１　加强养殖场饲养管理　新生仔猪及时饲喂初乳，注意仔猪防寒保暖；断奶　仔猪提供全价饲料，提高抵抗力；保证畜舍内通风，防　止饲养密度过大；做好卫生消毒工作，严格控制人员、　猪只流动，畜舍外每天采用３％火碱进行消毒，畜舍内　使用高效且刺激性小的消毒威等消毒液加大稀释倍数进　行带猪消毒。　１．４．２　做好免疫接种工作　对该养殖场母猪、哺乳仔猪、断奶仔猪进行猪轮状　病毒弱毒苗、猪圆环病毒弱毒苗紧急免疫接种。　１．４．３　发病猪的治疗与处理　对于发病仔猪，采取隔离措施，并对腹泻物污染的　设备、饲料等进行严格消毒；停止饲喂母乳，采用抗病　毒、抗细菌药物，防止猪圆环病毒２型引发继发感染，　并配合免疫球蛋白进行治疗，口服糖盐水或静脉注射　１０％葡萄糖盐水和３％　５％碳酸氢钠溶液，补充Ｖｃ。　对于治疗无效仔猪，立即扑杀，严格的无害化处理。　２　结果与分析　２．１　临床症状及病理解剖结果　送检３头仔猪表现现为精神沉郁，怕冷，体型消瘦，　腹泻严重，拉黄色粪便。经养殖户了解到该生猪养殖场　共饲养母猪２６０多头，所产仔猪近期有２０％左右发病，　发病时间已达２个多月，发病仔猪死亡率不高，仔猪从　※种植与养殖　农业与技术　２０１　７，ＶｏＬ３７，Ｎｏ．Ｏ１　１３７　出生的第２天发病，主要症状表现腹泻，拉黄色粪便，　仔猪断奶后病情有所好转，同养殖场大猪、保育猪均表　现正常。　本无法确诊，科学的诊断必须在此基础上进行实验室检　测。ＲＶ实验室检测可以采用电镜法、放射免疫实验、　ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法和ＰＣＲ病原检测等　。ＰＣＶ－２实验　室检测包括病毒分离与鉴定、间接免疫荧光技术、免疫　实验窜剖检３头仔猪，可见仔猪肾脏出血、肠膨气　胀肿、肺出血变白、脾脏肿大，结合腹泻仔猪临床症状、　及养殖场发病情况调查，初步怀疑仔猪感染病毒性疾病。　２．２　ＰＣＲ检测结果与分析　组化技术、ＰＣＲ病原检测等［８１ｏ　ＰＣＲ技术具有特异性强、　敏感度高、快速、简便、重复性好等突出优点，在动物　疫病病原学检测中越来越受欢迎，ＰＣＲ技术在不断完善　与改进，临床已有成熟的ＰＣＲ方法进行猪轮状病毒、猪　圆环病毒２型的检测。此次实验室检测正是采用ＰＣＲ技　术。　３头仔猪样品ＰＣＲ检测结果显示（见图１）：１号　猪组织样品猪圆环病毒抗原检测出现阳性条带，片段大　小为７０１ｂｐ；１号猪、２号猪、３号猪组织样品轮状病毒　抗原检测出现阳性条带，片段大小为３７４ｂｐ；均与预期　相符，其他病毒检测结果均为为阴性；说明该生猪养殖　根据腹泻仔猪临床症状、剖检病理变化以及实验室　ＰＣＲ检测结果，确诊为该养殖场发生了猪圆环病毒２型　场发生了猪圆环病毒２型和猪轮状病毒的混合感染。　（ＰＣＶ－２）与猪轮状病毒（ＲＶ）混合感染。该养殖场仔　猪腹泻主要发生在哺乳仔猪，揭示母源抗体水平下降。　此次腹泻由猪轮状病毒感染引发，而猪圆环病毒感染则　使病情进一步恶化。　在确定病因后，养殖场立即采取对母猪、哺乳仔猪、　断奶仔猪紧急免疫接种猪圆环病毒２型弱毒苗、猪轮状　病病毒弱毒疫苗，对发病仔猪进行隔离治疗以及加强养　殖场饲养管理等方面措施，最终控制了疫情。　４结论　该养殖场发生了猪圆环病毒２型与猪轮状病毒混合　感染疫情，通过对母猪、断奶仔猪、哺乳仔猪进行疫苗　图１目的基因ＰＣＲ扩增结果　ｌ：猪瘟阴性对照；２－４为ｌ号、２号、３号猪ＣＳＦＶ基因　ＰＣＲ扩增产物　５：猪蓝耳阴性对照；　６　８为１号、２号、３号猪ＰＲＲＳＶ　基因ＰＣＲ扩增产物　９：猪圆环阴性对照；１０　ｌ２为ｌ号、２号、３号猪ＰＣＶ　２　基因ＰＣＲ扩增产物　免疫，以及加强养殖场饲养管理等措施，最终控制了疫　情。　参考文献　Ｉ１ｊ郭莲华．仔猪腹泻的鉴别诊断及防治【Ｊ１．云南畜牧兽医，　２０１４（０１）：５　６．　ｌ４：绪轮状病毒阴性对照；ｌ５一ｌ７为１号、２号、３号猪　ＲＶ基因ＰＣＲ扩增产物　ｌ８：猪传染性胃肠炎阴性对照；１９　２１为１号、２号、３号　猪ＴＧＥＶ基因ＰＣＲ扩增产物　２２：猪流行性腹泻阴性对照；２３　２５为ｌ号、２号、３号猪　ＰＥＤＶ基因ＰＣＲ扩增产物　【２】胡志钢．仔猪腹泻的鉴别诊断与防治【Ｊ】．畜牧兽医科技信　息，２０１４（０３）：８９　９０．　【３　Ｊ王冰，高玉琢，张勇力．猪轮状病毒病的流行、诊断及防治　【Ｊ】．养殖技术顾问，２０１４（０６）：１４２．　『４１焦静波．猪轮状病毒病诊断与防制…．畜牧与饲料科学，　２＿３　治疗结果　２００９（Ｚ１）：５３　５６．　采取１．４所述治疗措施７ｄ后四访，养殖场未出现新　病例，１４ｄ后叫访，疫情已被控制，养殖场正常运转。　【５】谷建．一冽猪圆环病毒２型与猪肺炎支原体混合感染的诊断　【ＪＪ．现代畜牧兽医，２０１５（０１）：４０—４３．　【６】全锡帅，王东，韩涛，陈阳，孔琦．一例猪圆环病毒病的诊　断［Ｊ１．当代畜牧，２０１５（２４）：１６　１８．　３　结果讨论　临床卜猪圆环病毒２型与猪轮状病毒混合感染仔猪　『７】孙德兴．猪轮状病毒病诊断与防治方法【Ｊｌ＿农民致富之　友，２０１５（２１）：８６．　（下转第¨５页）　的案例并不常见，仪根据病猪临床症状和病理变化，根　※气象科学　农业与技术　２０］７，Ｖｏ１．３７，Ｎｏ．Ｏ１　１４５　被作物利用，故而在温度许可的条件下，要尽量多的适　叶　时的让作物采光，如有必要可以进行人工补光，以增加　以防止植物组织发生霉变而引起病虫害。　光照的水平，促使农作物进行光合作用。　４．５　适时的喷施农药　３－３　使用药物进行病害的防治　做好病虫害的预防工作，增加作物的抗病力。　如若作物已经出现病害必须要马上用药，多选用粉　质药物进行喷施，同时辅助喷洒叶面肥，保证农作物所　５　结论　需的各种营养元素得到充分的补充，避免根系出现吸收　随着经济的发展，排放到空气中污染物在增多，出　障碍　】，预防作物因肥料摄入不足而引发的各种病症。　现气象异常的状况的概率也在增加，对人们的生产生活　４减弱大雾对大田作物影响的建议　产生的影响也越来越大。对于大雾对农业活动产生的影　响，有针对性的给出一些解决的建议很有必要。随着我　４．１　适时的对作物的根部土壤进行疏松或者培土　国气象业务不断地发展和建设对灾害天气的预测能力更　以此增加根系土壤的透气性，对作物的根系形成保　强也更精准，而减弱雾对人们生产生活的影响也是防灾　护，以及提升土壤的温度。在大雾过后也能够提升根部　减灾工作的主要内容之一。　的活动能力，使农作物对由大雾导致的降温的抵御能力　得到提升，同时抵抗病害的能力也有一定的提高。　参考文献　４．２　适时的施肥　【ｌ】陈磊．雾害的影响及预防措施【Ｊ】．农业灾害研究，２０１２（８）：　借此为作物提供充足的养料来缓解有大雾所导致的　３２－３５．　作物营养物质的缺失。补给充足的能量，保证天气转好　［２］李相岭，王冬，王金香，郭丽曼．雾天对菜生长的影响及应　后作物的光合作用不受影响。　对措施［Ｊ］．现代农村科技，２０１．１（１．９）：１９—２０．　４－３　使用物理方法来减少温度的降低　［３】张福斌，余清波．浅谈雾对农业生产的影响『Ｊ］．吉林农业（学　在条件允许的情况下，可以选择性的在较脆弱的田　术版），２０１２（６）：１４６．　块盖上适量的稻草或者是其他覆盖物，起到提升地温和　【４】杨光艳．大雾天气对农业生产的影响与防范【Ｊ】．农业科技与　保护作物的作用　如果有必要也可以进行烟熏或者是提　信息，２０１６（８）：７９－８０．　升覆盖物的厚度。　【５　Ｊ王景琦，赵向龙．雾霾天气对北方农业生产的影响及预防措　４．４　剪切掉作物植株上枯死的枝条以及变黄的茎或者　施【ＪＪ．吉林农业，２０１４（２４）：７０．　（上接第１３７页）　［８】孟宪奎，任锐，孟宪伟，吕雪峰．一例圆环病毒引起仔猪腹　【ｌ３】陈全中．规模猪场猪圆环病毒病的诊断与临床控制【Ｊ】．上　泻的诊断【Ｊ】．吉林畜牧兽医，２０１１（０９）：３７—３８．　海畜牧兽医通讯，２ｏ１３（Ｏ１）：４３—４５．　【９］葛建强．轮状病毒病的防控［Ｊ】．畜牧与饲料科学，２０１０（Ｚ２）：　［１４】刘志杰，周莉，曾智勇，李如举．一例猪细小病毒、猪圆　１４８－１４９．　环病毒２型、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断　．　［１０】吴洪涛．猪轮状病毒病的防控技术［Ｊ］．湖北畜牧兽　中国畜牧兽医，２ｏ１２（ｏ６）：２０４－２０６．　医，２０１６（０２）：３０－３１．　【ｌ５】柯璐．猪圆环病毒病的检测评估及防控措施【Ｊ】．福建畜牧　【ｌ１】翁善钢．猪轮状病毒感染　１起仔猪腹泻的重要疾病［Ｊ】＿猪　兽医，２０１５（０６）：１－３．　业科学，２０１４（０９）：７２－７３．　【ｌ２］吴秀珠．规模猪场猪圆环病毒２型的危害及防控技术［Ｊ】．　作者简介：熊文海（１９７９一），男，云南省临沦市凤庆县人　福建畜牧兽医，２０１４（０４）：６１－６２．　大学专科学历，助理兽医师，现从事动物疫病防控工作。