青霉素发酵效价的生物学测定

青霉素发酵效价的⽣物学测定⼀、实验⽬的

1、了解青霉素作⽤的机理

2、了解青霉素效价的⽣物学测定的原理3、掌握管碟法测量抗⽣素效价的⽅法4、掌握青霉素摇瓶培养的操作流程⼆、实验原理

（⼀）、青霉素及作⽤的机理

1.抗⽣素：是某些微⽣物在其代过程中所产⽣的，能抑制或杀灭

其他病原微⽣物的化学物质；是细菌、真菌、放线菌等微⽣物的代产物。主要从微⽣物的培养液中提取，能杀死或抑制其他病原微⽣物。

在低浓度即可对某些⽣物的⽣命活动有特异⼀直作⽤的化学物质的总称。2. 青霉素

天然青霉素系从青霉菌的培养液中提取获得，主要含有：青霉

素F、G、X、K和双氢F五种。其中以青霉素G(⼜名苄青霉素)的作⽤最强，性质较稳定，产量亦较⾼。青霉素G的结构：青霉素钾、钠的结构：青霉素钾盐、钠盐的性质：

遇酸、碱或氧化剂等迅速失效。有引湿性；在⽔中极易溶解，⼄醇中溶解，在脂肪油或液状⽯蜡中不溶。

⽔溶液在室温放置易失效；20万IU/ml青霉素溶液于30 ℃

放置24h，效价下降56%，青霉烯酸含量增加200倍，临床应⽤时要新鲜配制。（所以只有粉制剂，没有注射液，⽤时⽤注射⽤⽔稀释；如使⽤不完，放置不要过久）。3. 青霉素作⽤机理

使细菌细胞壁缺损(黏肽)，菌体的⾼渗透压使细胞外⾯的⽔分不断地渗⼊菌体，引起菌体膨胀变形，加上激活⾃溶酶，使细菌裂解⽽死亡.G+

(⼆)青霉素效价的⽣物学测定的原理

1.效价:是评价抗⽣素效能的标准，也是衡量抗⽣素活性成分含量的尺度

微⽣物鉴定法：以抗⽣素对微⽣物的杀伤⼒或抑制

程度为指标来衡量抗⽣素效价的⽅法理化⽅法：根据抗⽣素的结构特点，利⽤其特有的化学或物理性质及反应⽽进⾏的

抗⽣素活性表⽰⽅法：抗⽣素的活性以效价单位来表⽰;每ml或每mg中含有某种抗⽣素的有效成分的多少，⽤

单位u表⽰

⼀个青霉素效价单位：能在50mL⾁汤培养基中完全抑制⾦黄⾊葡萄球菌发育的最⼩青霉素剂量;以IU表⽰1mg青霉素G钠盐定为1667单位；1mg青霉素G钾盐为1595单位

(三) 管碟法测量抗⽣素效价的⽅法

1.利⽤抗⽣素在培养基的扩散渗透作⽤，将已知效价的标准品溶液与未知效价的被检品溶液在同样条件下加⼊已放置在含有⾼度敏感性的试验菌的培养基上的⼩管

2.培养后，在抗⽣素扩散到达的适当围，产⽣了透明的抑菌圈。不同浓度的抗⽣素，抑菌圈的⼤⼩不同；⽐较标准品与检品的抑菌圈⼤⼩，利⽤不同的计算原理，就可以推算出此抗菌素的效价(四)青霉素摇瓶培养的操作流程

1.菌种活化:从保藏菌种接种到灭菌的斜⾯培养基中,25℃培养6-7天;待斜⾯上长满菌苔后作为以及菌种制备的起始菌株2.⼀级斜⾯菌种制作:从起始菌株斜⾯接种到灭菌的斜⾯培养基, 25℃培养6-7天,如⽆杂菌污染及为⼀级斜⾯菌种3.摇瓶培养:从⼀级斜⾯菌株接种到三⾓瓶液体培养基, 25℃、200rpm培养6-7天,可进⾏青霉素的效价测定等4.发酵罐培养:

流程：冷冻管→斜⾯母瓶（1）→⼤⽶孢⼦（2）→⼀级种⼦罐（3 ）→⼆级种⼦罐（4）→发酵罐（5）→放罐⾄提炼各步所需培养条件：1. 25℃，6—7天；2. 25℃，6—7天；

3. 25℃，40—45h，1：2VVM(每分钟通⽓体积⽐)4. 25℃，13—15h，1：1.5VVM;5. 22-26℃，6—7天，1：1—0.8VVM。三. 实验材料1.菌种

产黄青霉菌(Pentcillium chrysogenum)⾦黄⾊葡萄球菌(Staphyloco ccusauoreus)2.药品青霉素钠

0.2mol/L pH 6.0磷酸缓冲液0.85%⽣理盐⽔发酵培养基⽣物测定培养基

3.仪器及器⽫移液枪⽆菌枪头接种环酒精灯烧杯培养⽫滴管试管超净⼯作台等四. 操作步骤

1.发酵培养基的配制:按照配⽅配制液体培养基，250ml三⾓瓶装液量为100ml。

2.摇瓶培养:从⼀级斜⾯菌株接种到三⾓瓶液体培养基, 25℃、200rpm培养6-7天,可进⾏青霉素的效价测定

3. 青霉素标准溶液的配制:准确称取纯苄青霉素钠0.06g,溶解在pH 6.0的磷酸缓冲液, 配成100ml 1000单位/ml的青霉素标准⼯作液.按下表加⼊青霉素标准溶液

1mg青霉素G钠盐定为1667单位1000/1667 mg = 0. 6mg 1000单位100ml 1000单位/ml 100*0.6mg=0.06g称取0.06g 苄青霉素钠溶于100ml的磷酸缓冲液不同浓度青霉素标品溶液的配制

4.⾦黄⾊葡萄球菌菌悬液的制备

将37℃培养16-18h的斜⾯菌种,⽤0.85%的⽣理盐⽔洗下,离⼼沉淀(3000rpm*5min),倾去上清液,沉淀菌体再⽤⽣理盐⽔离⼼洗涤1-2次

再将其稀释⾄⼀定浓度(约109个/ml，或⽤分光光度计在波长650nm测透光率为20%左右即可)。5、⽣测平板的制备

配制⽣测培养基500ml，灭菌后冷却⾄50℃，每10ml加⼊

适当稀释的⾦黄⾊葡萄球菌0.3ml（15ml），充分混匀；在超净台中倒平板注意：实验中加菌体的量要控制在使10单位/ml青霉素溶液的抑菌圈直径在20～24mm之间。6. 青霉素标准曲线的绘制

⽣测培养基平板完全凝固后，在每个琼脂平板上轻轻放置⽜津

杯2个，⼩杯之间的距离要均匀。然后⽤移液枪加⼊不同浓度的青霉素标准溶液，200ul/⽜津杯。每个青霉素浓度做3个平⾏平⽫

加⼊标准青霉素溶液后，将平⽫移⾄37℃培养箱中培养18～24h，移去⽜津杯。精确测定抑菌圈的直径⼤⼩。

在坐标纸上,以青霉素浓度为纵坐标,以抑菌圈直径的校正值为横坐标，绘制标准曲线7. 青霉素发酵液效价的测定

根据发酵时间⽤1% pH 6.0的磷酸缓冲液将发酵液适当稀释.

每个被测样品⽤3套平⽫进⾏测定.青霉素标准液(1单位/ml)与待测样品的稀释液间隔的加⼊⼩管.37℃培养18-24h后,量取抑菌

圈直径的⼤⼩8.青霉素效价的计算:

将青霉素标准液(10单位/ml)的抑菌圈直径进⾏校正,取得校正值;将此校正值校正待测样品的抑菌圈直径;在标准曲线上根据校正后的抑菌圈直径查得待测稀释液的青霉素效价;根据稀释度得到发酵液的青霉素效价五、试验结果

1.不同浓度青霉素标品的抑菌圈直径及相应的标准曲线不同浓度青霉素标品的抑菌圈直径

2.据上⾯标准曲线的⽅程y=0.0096x+14.513(R2=0.9675),计算出发酵液的青霉素效价为

注：由于实验过程中使⽤的是原液，因此稀释倍数为⼀