建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法

维普资讯 http://www.cqvip.com 口　４　建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法　胡大利冯宇①张培因①冉波卫红飞①邵明玉王爱丽①　王丽颖①予永利　（吉林大学基础医学院免疫学教研室，长春１３００２１）　中国图书分类号Ｒ３９２－３３　文献标识码Ａ　文章编号１０００－４８４Ｘ（２００７）０４－０３４５－０４　［摘要］　目的：研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）感染后的动物血清中特异性抗体的可能性，为　建立一种非病毒颗粒的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒提供实验依据。方法：利用自行构建表达的Ｏ型口蹄疫病毒ＶＰ１表位肽重组蛋白　（ＶＰ１ｅｐｉ）作为包被抗原，采用间接ＥＬＩＳＡ方法确定抗原的最佳工作浓度和包被方法，优化各项实验条件，并以ＦＭＤＶ感染后　的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ＥＬＩＳＡ方法的特异性和灵敏度。结果：ＦＭＤＶ感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别　ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白，用此蛋白包被检测抗ＦＭＤＶ抗体的灵敏度可达１：３　２００，并证明所检测的抗体是ＦＭＤＶ特异性的。结论：　ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白可以替代ＦＭＤＶ颗粒用于建立检测抗ＦＭＤＶ抗体的ＥＬＩＳＡ试剂盒。　［关键词］　口蹄疫病毒；抗口蹄疫病毒抗体；ＶＰ１表位重组蛋白；间接ＥＬＩＳＡ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＦＭＤＶ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ＨＵＤａ—Ｌｉ，ＦＥＮＧ　Ｙｕ，ＺＨＡＮＧ　Ｐｅｉ—　ｎ，ＲＡＮＢｏ，ＷＥＩＨｏｎｇ一　，ＳＨＡＯ　Ｍｉｎｇ—Ｙｕ，ＷＡＮＧＡｉ—Ｌｉ，ＷＡＮＧ　Ｌｉ—Ｙｉｎｇ，　ＹＵ　Ｙｏｎｇ—Ｌｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１　３００２　１，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｓｏｍｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｄａｔａ　ｆｏｒ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｖｉｒｕｓ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ａｓ　ｃｏａｔｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ．　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓ　ｃｏａｔｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｆｒｏｍ　ｓｅｒａ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌｓ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｏｏｔ—ａｎｄ．ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｕｒｓ（ＦＭＤＶ）ＷａＳ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏａｔｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　ｓｅｌｆ－ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｔｙｐｅ　Ｏ　ＦＭＤＶ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ＶＰ１　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏ—　ｔｅｉｎ（ＶＰ１　ｅｐｉ）Ｗａｓ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｏｆｒ　ｉｔｓ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｃｏａｔｉｎｇ　ｍａｎｎｅｒ　ｎａｄ　ｏｔｈｅｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｌａ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ．Ｍｅａｎ—　ｗｈｉｌｅ，ＦＭＤＶ－ｉｆｎｅａｅｄ　Ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｓｅｒａ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｒａ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈ．　ｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｒａ　ｆｒｏｍ　Ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｉｆｎｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＦＭＤＶ　ｃｏｕｌｄ　ｗｅｌｌ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ＶＰ１　ｅｐｉ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ａｎ－　ｔｉ－ＦＭＤＶ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｉｓ　ｍｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅａｃｈｅｄ　１：３　２００．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ＦＭＤＶ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ＶＰ１　ｅｐｉ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｎ　ｒｅｐｌａｃｅ　ＦＭＤＶ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｔｏ　ｓｅｔ　ａｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ａｎｔｉ．ＦＭＤＶ　ａｎｔｉｂｏｄｙ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｕｒｓ（ＦＭＤＶ）；Ａｎｔｉ—ＦＭＤＶ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＶＰ１一ｅｐｉｔｏｐｅ　ｒｃｅｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ　口蹄疫（Ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＦＭＤ）是由口蹄　确地诊断出感染ＦＭＤＶ的家畜，对非疫区的动物实　疫病毒（ＦＭＤＶ）感染偶蹄类动物而引发的一种急　施疫苗接种是控制口蹄疫蔓延的主要策略［３］。ＦＭ—　性、热性、高度接触性传染病，易感动物包括牛、羊、　ＤＶ包括７种血清型，即Ａ、Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａｌ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、　猪等２Ｏ个科的７Ｏ多种家养和野生哺乳动物，被联　ＳＡＴ３型，我国流行的主要是Ｏ型Ｅ４］。ＶＰ１是ＦＭＤＶ　合国粮农组织和国际兽医局列为Ａ类家畜传染病　的Ｐ１基因编码的病毒衣壳蛋白的主要组成部分，是　的首位…。口蹄疫近年来多次在世界发生大范围　ＦＭＤＶ最主要的免疫原性蛋白，能刺激机体产生抗　流行，严重影响畜牧业生产和国际贸易＿２　Ｊ。快速准　ＶＰ１抗体，该抗体也是ＦＭＤＶ的中和性抗体　］。因　此，抗ＶＰ１抗体已成为诊断ＦＭＤＶ感染的重要指标。　①吉林大学基础医学院分子生物学教研室。长春１３００２１　作者简介：胡大利（１９８０年一），男，博士，主要从事基因工程疫苗的　我们研制的ＶＰｌｅｐｉ重组蛋白是利用基因工程　研究；　技术将Ｏ型口蹄疫病毒ＶＰ１的Ｔ、Ｂ细胞表位以一　通讯作者及指导教师：于永利（１９５５年一），男，博士，教授，博士生导　定形式组合在一起，在大肠杆菌中表达并纯化而得　师，主要从事基因工程疫苗研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｌｙｕ　到的一种重组蛋白，它具有良好的空间构象，能够被　＠ｍａｉｌ．ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；　抗ＦＭＤＶ抗体特异性识别。因此，我们尝试用这种　王丽颖（１９５８年一），女，博士，教授，博士生导　重组蛋白作为包被抗原，研究以间接ＥＬＩＳＡ方法检　师，主要从事肿瘤疫苗开发和研究，Ｅ—ｍａｉｌ：　测ＦＭＤＶ感染后的豚鼠血清中抗ＦＭＤＶ特异性抗　ｗｌｙｉｎｇ＠ｍａｉｌ．ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。　体的可能性。　维普资讯 http://www.cqvip.com ｌ材料与方法　１．１主要试剂和动物血清ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白由吉　林大学基础医学院分子生物学教研室提供；ＦＭＤＶ　阳性豚鼠血清系用商品化口蹄疫灭活疫苗（内蒙金　宇集团生物制药厂生产）免疫豚鼠后获得；辣根过　氧化物酶（ＨＲＰ）标记的兔抗豚鼠ＩｇＧ抗体购自Ｓｉｇ—　ｉｌｉａ公司；脱脂奶粉购自Ｆｌｕｋａ公司；牛血清白蛋白　（ＢＳＡ）购自国药集团化学试剂有限公司；ＯＰＤ购自　上海白鹤化工厂；ＤＡＢ购自北京鼎国生物技术公　司；Ｍｕｈｉｓｋａｎ　Ａｓｃｅｎｔ型酶标仪由芬兰Ｔｈｅｒｍｏ　Ｌａｂ—　ｓｙｓｔｅｍｓ公司生产。　１．２用ＦＭＤＶ阳性豚鼠血清检测ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白　按常规免疫印迹技术，取４０　ｇ　ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白　上样，１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，用电转移法将蛋白从聚　丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维滤膜上，５％脱脂奶溶　液室温封闭过夜；ＰＢＳ洗涤后加入用封闭液１：１００　稀释的阳性豚鼠血清，室温２小时；洗涤，加入用封　闭液ｌ：ｌ　０００稀释的ＨＲＰ标记的兔抗豚鼠ＩｇＧ抗　体，室温２小时；洗涤，ＤＡＢ底物液中显色　Ｊ。　１．３间接ＥＬＩＳＡ方法最适实验条件的确定　１．３．１最适抗原工作浓度和血清稀释度的确定　将ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白和已知阳性及阴性豚鼠血清分　别倍比稀释，在９６孔酶标板上进行方阵滴定，用酶　标仪检测４９２　ｎｍ的ＯＤ值，取阳性值１．０左右，阴　性值０．２左右，空白对照小于０．１的反应孔的蛋白　浓度和血清稀释度作为最适抗原工作浓度和血清稀　释度。　１．３．２间接ＥＬＩＳＡ方法各项实验条件的优化在　最适抗原浓度和血清稀释度的基础上，分别对包被　液、封闭液的种类以及酶标抗体的稀释度进行筛选，　再对包被条件、封闭条件、血清样品反应条件、酶标　抗体反应条件、显色条件、洗涤方法等操作逐一优　化，每次检测４９２　Ｂｉｎ的ＯＤ值，按阳性血清与阴性　血清ＯＤ值之比（Ｐ／Ｎ值）最大，且阴性血清及空白　对照的ＯＤ值较低的原则确定反应条件。　１．３．３间接ＥＬＩＳＡ方法检测结果判定标准的确定　用建立的间接ＥＬＩＳＡ方法检测２４份阴性豚鼠血　清，经统计学分析得到阴性血清在４９２　ｎｍ的ＯＤ值　范围为（Ｘ±Ｙ），在此基础上规定阳性判定标准为　Ｓ／Ｎ≥２．１。　１．４间接ＥＬＩＳＡ方法的特异性、灵敏度和重复性　实验　１．４．１　特异性实验用两种方法确定检测的特异　性：①用ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白（１０　ｇ／ｍ１）与阳性血清　中国免疫学杂志２００７年第２３卷　（１：１００）进行中和反应，４￣Ｃ　２０小时，再用建立的间　接ＥＬＩＳＡ方法检测中和前后血清中抗ＶＰ１抗体的　含量。②再用灭活ＦＭＤＶ作为包被抗原，以间接　ＥＬＩＳＡ方法检测ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白免疫后的豚鼠血　清中抗ＦＭＤＶ抗体水平。　１．４．２灵敏度实验将阳性和阴性血清平行倍比　稀释，按建立的间接ＥＬＩＳＡ方法检测血清中抗ＦＭ—　ＤＶ抗体的含量，将Ｓ／Ｎ值Ｉ＞２．１的最大血清稀释度　作为检测的灵敏度。　１．４．３重复性实验按建立的间接ＥＬＩＳＡ方法，　用４块酶标板在不同时间对阳性和阴性血清各６份　做“板内重复试验”和“板间重复试验”，每份样品每　板重复７次，并对检测结果进行统计学分析，判断检　测结果的可重复性。　２　结果　２．１　ＦＭＤＶ阳性豚鼠血清与ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白特异　性结合免疫印迹检测结果证实，ＦＭＤＶ感染后的　阳性豚鼠血清能特异性识别ＶＰ１　ｅｐｉ重组蛋白，这为　进一步建立间接ＥＬＩＳＡ检测方法提供了实验依据，　见图１。　２．２检测抗ＦＭＤＶ抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法的实验　研究　２．２．１最适抗原工作浓度和血清稀释度　通过方　阵滴定实验最终确定ＶＰ１　ｅｐｉ重组蛋白的最适工作　浓度为２　ｇ／ｍｌ，豚鼠血清最适稀释度为１：２００，见　表１。　２．２．２间接ＥＬＩＳＡ方法各项实验条件的确定实　验结果表明，用碳酸盐溶液（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）稀释抗原，　４℃过夜，包被效果明显优于戊二醛（Ｇｌｕｔｒａａ１）和　ＰＢＳ（图２Ａ）；用１％ＢＳＡ与５％脱脂奶粉的混合液　作为封闭液，３７￣Ｃ　１小时，封闭效果最佳（图２Ｂ）；酶　Ａ　１　２　３　ｋ１）　Ｂ　９７　６６　ＶＰｌｅｐｉ　４５—－．．　３０　２０　图１　ＭＤＶ感染后的豚鼠血清特异性识别Ｖｍｅｐｉ重组蛋白　Ｆｉｇ．１　Ｓｅｒａ　ｆｒｏｍ　ＦＭＤＶ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ￣ｑｌｌｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｒｅｃｏｌ　ＶＰｌｅｐｉ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　Ｎｏｔｅ：Ａ．１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ；１．ＶＰ１ｅｐｉ：２．ＢＳＡ；３．Ｍａｒｋｅｒ；Ｂ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．　维普资讯 http://www.cqvip.com 口　ＥＬＩＳＡ方法第４　＾；：　《　自＿’Ｉ　．譬置《　＾昌目Ｎ—譬适　—　－一　《＞—口＿’Ｉ！Ｉ．！Ｉ目・ｌ　ｌ　３４７・　Ｏ　Ｏ　０　Ｏ　２　Ｏ　８　６　４　２　Ｏ　表１方阵滴定实验中４９２　ｎｍ的ＯＤ值（　±　）　一昌ＩＩ　寸《一　ｌ　ｌ　ｌ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　０　４　２　Ｏ　８　６　４　２　Ｏ　Ｔａｂ．１　ＯＤ　ｖａｌｕｅ　ａｔ　４９２　ｎｍ　ｉｎ　Ｓｑｕａｒｅ　ｍａｔｒｉｘ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（　４－Ｓ）　一昌ＩＩ　堇　—　一　＞盆　¨　＝：４　２　Ｏ　８　６　４　　ＪⅧ‘Ｓｕｇａｒ　ＢＳＡ　Ｓｕｇａｒ　Ｄｉｌｕｆｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ　＋１％ＩＩｓＡ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ＩｇＧ／ＨＲＰ　图２间接ＥＬＩＳＡ方法实验条件的优化　２　Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉＥＬＩＳＡ　Ｎｏｔ　：　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏａｔｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｂ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｃ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｒ￣／ＨＲＰ　Ａｂ．　言０．４　霉０．３　星Ｏ．２　《　言０．１　Ｂｅｆｏｒｅ　Ａｔｉｅｒ　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｒａ　图３间接ＥＬＩＳＡ方法检测抗ＦＭＤＶ抗体的特异性　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｓｅｒａ　№３　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ａｎｔｉ－ＦＭＤＶ　Ａｂ　ｔｈ　ｉＥＵＳＡ　图４　间接ＥＬＩＳＡ方法检测抗ＦＭＤＶ抗体的灵敏度　Ｎｏｔｅ：Ａ．Ａｎｔｉ—ＦＭＤＶ　Ａｂ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＦＭＤＶ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｓｅｒ＇Ａ　ｂｅｆｏｒｅ　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｉｔｖｉｔｙ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ａｎｔｉ－ＦＭ口【＇Ｖ　Ａｂ　ｗｉｔｈ　ａｎｄ舳ＶＰＩ　ｅｐｉ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｂ．Ａｎｔｉ—ＦＭＤＶ　Ａｂ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＶＰ１　ｅｐｉ　ｉＥＬＩＳＡ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｓｅｍ．　作为包被抗原的间接ＥＬＩＳＡ方法在检测抗ＦＭＤＶ　标抗体的最佳稀释度最终确定为１：１０　０００（图２Ｃ）。　抗体方面具有特异性。用灭活ＦＭＤＶ包板检测　２．２．３间接ＥＬＩＳＡ方法的特异性ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋　ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白免疫后的豚鼠血清中抗ＦＭＤＶ抗　白中和后的阳性血清中抗ＶＰ１抗体水平明显降低，　体的含量，结果显示，ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白免疫后的豚鼠　阻断率达５７．１％（图３Ａ），说明以ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白　血清中含有抗ＦＭＤＶ抗体（图３Ｂ），这说明ＶＰｌｅｐｉ重　¨　维普资讯 http://www.cqvip.com 中国免疫学杂志２００７年第２３卷　组蛋白与ＦＭＤＶ表面的ＶＰ１具有相似的空间构象。　利用该蛋白质替代病毒作为包被抗原的重要特征。　２．２．４间接ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度和可重复性对　实验结果表明，利用基因工程技术从大肠杆菌中表　倍比稀释的阳性和阴性血清的检测结果显示，当血　达的ＶＰ１ｅｐｉ重组蛋白可以用于检测抗ＦＭＤＶ抗体，　清稀释度达到１：３　２００时，Ｓ／Ｎ值仍大于２．１，说明　在本次实验中我们确定了包被抗原的最适工作浓度　该方法的灵敏度为１：３２００，见图４。用４块酶标板　和血清的最适稀释度，优化了各项实验条件，并评定　检测６份阳性血清和６份阴性血清，结果显示，板内　了该方法的特异性、灵敏度和可重复性，为利用这种　变异系数２．０％～１２．７％，板间变异系数４．０％～　重组蛋白进一步研制针对大型家畜的ＥＨＳＡ诊断　１３．１％，说明该方法的可重复性良好。　试剂盒提供了重要的实验依据；另一方面由于豚鼠　２．３间接ＥＬＩＳＡ方法的操作程序①用包被液将　是进行口蹄疫科学研究的重要实验动物，我们建立　ＶＰｌｅｐｉ重组蛋白稀释至２　ｇ／ｍｌ，１００　ＩｘＬ／：ｆＬ，４ｏＣ过　的ＥＬＩＳＡ检测方法也为开发新型口蹄疫疫苗和深　夜，洗涤３次，每次３分钟；②加封闭液，２００　ｌ／，孔，　入研究口蹄疫病毒的致病机理提供了抗体检测方面　３７０（２　１小时，同上洗涤；③将待测血清做１：２００稀　的帮助　释，１００　ｌ／，孔，３７￣Ｃ　１小时，同上洗涤；④将兔抗豚　鼠ＩｇＧ／ＨＲＰ做１：１０　０００稀释，１００　ｌ／，孔，３７ｏＣ　１小　４参考文献　时，同上洗涤；⑤加入现配的ＯＰＤ底物液，１００　ｌ／　１　Ｓｏｂｆｉｎｏ　Ｆ，Ｓａｉｚ　Ｍ，Ｊｉｍｅｎｅｚ．Ｃｌａｖｅｒｏ　Ｍ　Ａ　ｅｔ　ａ１．Ｆｏｏｔ．ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓ．　孔，避光显色１０分钟；⑥２０％稀硫酸终止反应，５０　ｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ：ａ　ｌｏｎｇ　ｋｎｏｗｎ　ｖｉｕｒｓ，ｂｕｔ　ａ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｔｈｒｅａｔ［Ｊ］．Ｖｅｔ　Ｒｅｓ，　／孔；⑦用酶标仪检测４９２　ｒｉｍ的ＯＤ值。　２００１；３２（１）：１．３０．　对２４份阴性豚鼠血清进行检测，得到阴性血清　２　Ｋｉｔｃｈｉｎｇ　Ｒ　Ｐ．Ｆｏｏｔ—ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ　ｗｏｒｌｄ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ［Ｊ］．　的ＯＤ值为０．１０１±０．０１８，根据Ｓ／ＮＩ＞２．１的标准，确　Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９９；１７（１３－１４）：１７７２－１７７４．　３　Ｓａｉｚ　Ｍ，Ｎｕｎｅｚ　Ｊ　Ｉ，Ｊｉｍｅｎｅｚ．Ｃｌａｖｅｒｏ　Ｍ　Ａ　ｅｔ　ａ１．Ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓ—　定阳性判定标准为４９２　ｎｍ的ＯＤ值不低于０．２５０。　ｅａｓｅ　ｖｉｕｒｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　３讨论　Ｉｎｆｅｃｔ，２００２；４（１１）：１１８３－１１９２．　４　Ｇｒｕｂｍａｎ　Ｍ　Ｊ，Ｂａｘｔ　Ｂ．Ｆｏｏｔ・ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｍｂｉｏｌ　针对口蹄疫病毒感染，已经建立了一系列检测　Ｒｅｖ，２００４；１７（２）：４６５－４９３．　方法，如病毒分离培养、中和试验、间接血凝试验、荧　５　Ｍａｓｏｎ　Ｐ　Ｗ，Ｇｒｕｂｍａｎ　Ｍ　Ｊ，Ｂａｘｔ　Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　光抗体技术、放射免疫电泳技术、ＲＴ．ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ　ｏｆＦＭＤＶ［Ｊ］．Ｖｉｕｒｓ　Ｒｅｓ，２００３；９１（１）：９－３２．　等　。其中ＥＬＩＳＡ方法以其快速，简便，更适合大　６　Ｌｏｇａｎ　Ｄ，Ａｂｕ—Ｇｈａｚａｌｅｈ　Ｒ，Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ　Ｗ　ｅｔ　ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａ　ｍａｊｏｒ　规模群体应用等特点，成为口蹄疫诊断的最常用方　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｓｉｔｅ　ｏｎ　ｆｏｏｔ－ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｕｒｓ　［Ｊ］．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９９３；３６２（６４２０）：５６６－５６８．　法，但目前检测抗ＦＭＤＶ抗体的ＥＬＩＳＡ试剂盒多采　７沈关心，周汝瞵．现代免疫学实验技术［Ｍ］．武汉：湖北科学技　用病毒颗粒作为包被抗原，生产过程中存在病毒扩　术出版社，１９９８：４１０－４１２．　散的危险，从而限制了其广泛应用　ｊ。为了克服这　８王莉娟，徐天刚，赵云玲ｅｔ　ａ１．口蹄疫诊断技术研究进展［Ｊ］．中　一缺陷，我们根据Ｏ型口蹄疫病毒的Ｐ１编码基因，　国畜牧兽医杂志，２００５；３２（３）：４ｌ　．　构建并在大肠杆菌中表达了ＶＰ１表位肽重组蛋白　９　Ｃｈｅｎａｒｄ　Ｇ，Ｍｉｅｄｅｍａ　Ｋ，Ｍｏｏｎｅｎ　Ｐ　ｅｔ　ａ１．Ａ　ｓｏｌｉｄ—ｐｈａｓｅ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　（ＶＰ１ｅｐｉ），并尝试利用这种蛋白代替ＦＭＤＶ颗粒，　ＥＬＩＳＡ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　Ｏ　ｆｏｏｔ—ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｎｌｓ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　建立一种特异性检测动物体内抗ＦＭＤＶ抗体的间　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｍａｓｓ　ｓｅｒｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅ￣ｏｄｓ，２００３；１０７（１）：８９－９８．　接ＥＨＳＡ方法。由于ＶＰｌｅｐｉ重组蛋白免疫的豚鼠　血清中含有能识别ＦＭＤＶ颗粒的抗体，推测其可能　［收稿２００５－０９—２０　修回２００５—１２－０１］　具有与ＦＭＤＶ表面ＶＰ１蛋白类似的空间构象，成为　（编辑　许四平张晓舟）　・消息・　２００７年《中国药学文摘》征订启事　《中国药学文摘》（ＩＳＳＮ１００３－３５２１／ＣＮ１１．２５２９／Ｒ）是由国家食品药品监督管理局主管，国家食品药品监督管理局信息中心　主办，国内外公开发行的医药科技性专业期刊。月刊，１６开本，每期２８０页左右，每期约８０万字。是国内药学期刊中唯一的　综合性文摘类刊物。收载国内外公开发行的７００余种药学相关学科期刊中的精粹文献。全年定价：４７６元。