腐乳前酵期微生物与理化成分的动态分析

2019 Vol.38 No.1Serial No.323

China Brewing

Research Report

腐乳前酵期微生物与理化成分的动态分析

许家威s李一红s叶芒s薛桥丽2,王知荣3,柴建国3,胡永金

(1.云南农业大学食品科学技术学院云南昆明650201;2.云南农业大学学报编辑部，云南昆明650201;

3.云南羊泉生物科技股份有限公司，云南牟定675500)

摘要:以牟定天台阳泉腐乳为样本，探究腐乳在前酵过程中的微生物含量及各理化成分的变化规律。研究结果表明，在腐乳前酵期微

生物的含量均先増长后下降，菌落总数、芽孢杆菌数以及霉菌和酵母的数量在晾晒期分别达到最高值9.11lg(CFU/g)、8.87lg(CFU/g)和

7.77 lg(CFU/g)，乳酸菌数量在腌坯期达到最高值8.28 lg(CFU/g)。水分含量在晾晒期有所降低，总酸、氨基酸态氮及水溶性蛋白含量

均呈上升的趋势，分别由白坯的 0.089 g/100 g、0.015 g/100 g、3.07 g/100 g 升高到蘸料期的0.39 g/100 g、0.32 g/100 g 和 10.23 g/100 g，游 离氨基酸含量在腌坯期达到最高为13 516.03 mg/kg。

关键词:腐乳;前发酵;微生物;理化成分;动态变化中图分类号:TS214.2

文章编号：0254-5071 (2019)01-0084-05

doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.01.017

引文格式:许家威，李一红，叶芒，等腐乳前酵期微生物与理化成分的动态分析

.[J].中国酿造，2019,38(1): 84-88.

Dynamic analysis of microorganisms and physical and chemical components during

sufu pre-fermentation

XU Jiawei1, LI Yihong1, YE Mang1, XUE Qiaoli2, WANG Zhirong3, CHAI Jianguo3, HU Yongjin1* (1.College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China;

2.Editorial Office，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China;3. Yunnan Yang^q^an Biological Technology Co., Ltd., Mouding 675500, China)

Abstracts Taking Tiantai Yangquan sufu as a sample, the microbial count and the changes of various physical and chemical components in the pre­fermentation process of sufu were studied. Results showed that the microorganisms count in the pre-fermentation period of the sufu increased first and then decreased. The total number of colonies, Bacillus and yeasts reached the highest values of 9.11 lg(CFU/g), 8.87 lg(CFU/g) and 7.77 lg(CFU/g), respectively during the drying period. The number of lactic acid bacteria reached the highest value of 8.28 lg(CFU/g) during salting pehtze period. The moisture decreased during the drying period, and the total acid, amino acid nitrogen and water-soluble protein content increased, which increased from 0.089 g/100 g, 0.015 g/100 g and 3.07 g/100 g of white pehtze to 0.39 g/100 g, 0.32 g/100 g and 10.23 g/100 g of the dipping period. The free amino acid content reached the highest of 13 516.03 mg/kg during the salting pehtze period.Key words： sufu; pre-fermentation; microorganism; physical and chemical components; dynamic changes

大豆是原产于我国的世界主要粮食作物，其蛋白质含 量丰富，且富含各种必需氨基酸，是人们主要的植物蛋白 来源[1]。几千年来，中华民族创造了各式各样的大豆制品， 如豆豉、豆酱、豆腐、腐乳、腐竹等，豆品文化根深蒂固[2]， 自2014年以来，每年有>80%的国产大豆用于豆制品加工[3]， 主要分为发酵和非发酵两大块，其中发酵豆制品由于其风 味、口感、营养丰富等特点深受人们的喜爱[4]。

腐乳是我国传统的发酵豆制品，已有近千年的历史， 含有丰富的营养成分，如必需氨基酸、脂肪酸、有机酸和 维生素等，具有抗氧化活性、抗突变性和许多其他有益的 生物活性[5-6]。腐乳是新鲜豆腐通过微生物和酶的发酵作用

收稿日期：2018-09-20

修回日期：2018-11-07

而形成的一种干酪型产品，在欧美，许多人把它称作中国 干酪（Chinese cheese)™。腐乳的生产过程一般分为前期培 菌和后期酵期。腐乳的前酵期是整个生产的关键步骤，菌 种在豆腐坯体上生长，形成茂密的菌丝后包裹坯体，使得 蛋白质部分降解[8]，同时在前酵期分泌的酶系将直接影响 腐乳后酵期产香物质的降解与酯化[9]，所以腐乳的前酵工 艺将直接影响腐乳的品质。而传统的腐乳生产大部分还是 作坊式生产，工业化水平低，大部分还是手工作业，在加工 中极易受到环境微生物的污染，如喻世哲等[1W1]曾检出腐 乳生产车间环境中菌落总数为4.53 lgCFU/m3,而过多的微 生物感染腐乳的生产不仅会导致风味口感的变化，更是会

基金项目：云南省科技创新强省专项项目（2016AB016)

作者简介:许家威(1995-),男，硕士研究生，研究方向为食品微生物、发酵食品。

*通讯作者:胡永金(1971-),男，教授，博士，研究方向为食品微生物、功能性食品与生物技术。

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引起生物胺的累积[12]，从而影响腐乳的品质。由于本样品 的生产采用的是自然发酵法，依靠稻草杆天然接种霉菌， 生产环境较为粗矿，故本次实验针对其中几种对腐乳生产 较为密切的微生物进行测定。

本研究对腐乳前酵各个时间段的菌落总数、芽孢杆菌 数、乳酸菌数、毛霉和酵母数、水分、总酸、氨基酸态氮、水 溶性蛋白以及游离氨基酸的含量进行检测，了解前酵期腐 乳的微生物和理化特性的动态变化，以期为腐乳工业化生 产打下科学的理论基础。1材料与方法 1.1材料与试剂

豆腐白坯、自然发酵1 d、2 d、3 d毛坯、晾晒1 d、2 d毛坯、腌坯以及蘸料后腌坯:云南省牟定县天台阳泉油腐乳 厂;马铃薯琼脂培养基、营养琼脂、平板计数培养基、MRS 培养基:广东环凯微生物科技有限公司；36%甲醛(不含聚 合物)：成都市科隆化学品有限公司;氢氧化钠、氯化钠(均 为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。1.2仪器与设备

SW-CJ-2D双人单面净化工作台：苏州净化设备有限

公司;BSC-250恒温培养箱:上海博讯实业有限公司医疗设 备厂;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅:上海申安有限公 司;PHS-3CpH计:上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3方法

1.3.1腐乳的加工工艺流程及操作要点

选料—浸泡—磨浆—过筛—煮浆—点浆—压榨成坯—划 块—发酵—晾晒—腌制—拌料—灌汤、装瓶—后酵—成品

操作要点：

选料:选颗粒整齐、无杂质、无虫眼、无发霉变质的新豆； 浸泡:常温浸泡，浸泡到大豆无硬心；

磨浆:加水、下料要协调一致，不得中途断水或断料； 过滤:用纱布过滤豆渣；

煮浆:温度控制在98〜102 °C，时间8〜10 min;点浆:酸浆水点浆，温度控制在54〜56 °C;

压榨成坯:机械压榨成型，压榨时间10〜11 h;划块:豆腐划成4 cmx4 cmx2 cm;发酵:发酵室内温度控制在20〜24 C左右，发酵时间 为65〜72 h，发酵至表面布满毛霉；

晾晒:太阳光自然照晒，晾晒时间8 h左右；腌制:用食盐腌制1 d，再用纯粮白酒冲洗后沥干； 拌料:在腌坯上裹一层由辣椒粉、花椒粉、食盐制成 的辅料；

灌汤、装瓶:将豆腐醅放入玻璃瓶中，加入菜籽油； 后酵:在常温条件下放置，自然发酵3个月；成品:包装印刷后出厂。1.3.2微生物指标的测定

菌落总数的测定参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》GB[13进行测定;乳酸菌总数的测定参照

4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》[14]进 行测定；霉菌和酵母的测定参照GB 4789.15—2016《食品 微生物学检验霉菌和酵母计数》进行测定[15];芽孢杆菌的 测定参照姚翔[16]的方法:在无菌条件下，将称取的25 g样 品放入装有225 mL无菌生理盐水(含玻璃珠）的灭菌三角

瓶中，浸泡，振摇30 min后，在电炉上加热煮沸10〜15 min 后冷却，用无菌水以1:10的稀释度递增稀释，选择3个合适 的稀释度，取样1 mL涂布于营养琼脂培养基上，37 C培养 48 h，计数。

1.3.3理化指标分析检测

水分含量的测定采用恒质量法[17];总酸及氨基酸态氮 的测定参照SB/T 10170—2007《腐乳新标准》进行测定[17]; 水溶性蛋白的测定参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的 测定》进行测定[18]，转换系数为5.71;氨基酸含量的测定参 照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》进行测定[19]。 1.3.4数据统计分析方法

运用IBM SPSS Statistics 19进行差异性显著分析，运 用Origin Pro 2018进行图表绘制。2结果与分析

2.1腐乳前酵期微生物变化分析

腐乳的品质与微生物有着密切的关联，对腐乳前酵期 微生物含量进行检测，结果见图1。

不同字母表示同种微生物差异显著(P<0.05)。下同。

图1

腐乳前酵期微生物的变化

Fig. 1 Changes of microorganisms during sufu pre-fermentation

process

由图1可知，在前酵期间，豆腐白坯和晾晒2 d后的豆 腐坯以及腌坯期的微生物变化较大。其中白坯检出的菌 落总数、芽孢杆菌数、乳酸菌数以及毛霉和真菌数分别 为5.10 lg(CFU/g)、5.01 lg(CFU/g)、4.94 lg(CFU/g)以及

4.54 lg (CFU/g)，随着毛霉的生长，其他微生物也迅速繁 衍，在晾晒期，菌落总数、芽孢杆菌数和毛霉和酵母的含 量达到一个顶峰分别为 9.11 lg(CFU/g)、8.87 lg(CFU/g) 和7.77 lg (CFU/g)，乳酸菌的含量在腌坯期达到最高值为• 86 •

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8.28 lg(CFU/g)。而之后用食盐盐渍及白酒冲洗后的腌坯 期豆腐坯的毛霉和酵母含量有一个明显的下降，而芽孢杆 菌和乳酸菌的数量无较大变化，表明食盐及白酒对于真菌 及一些其他微生物有较强的抑制作用。2.2腐乳前酵期水分含量的变化

在腐乳的前酵过程中不同的时期环境也不同，腐乳坯 水分含量也会发生变化，采用恒质量法对腐乳前酵期水分 含量进行测定，结果见图2。

Fig. 2 Changes of moisture during sufu pre-fermentation process

微生物的生长需要合适的水分，尤其对于由微生物发 酵的腐乳而言，前酵期水分含量的多少将直接影响发酵过 程中毛霉的生长，水分过低会影响毛霉的有氧呼吸，将影 响毛坯表面菌膜形成，水分过高则会为杂菌的生长提供有 利条件[20]。此外，水分含量的多寡会影响水、蛋白质与脂质 之间的作用力，从而对腐乳的形状、质构产生影响[21]。

由图2可知，在前酵过程中，水分含量在毛霉发酵期 间为77%左右，基本保持不变，适宜毛霉的生长，这也与图1 的微生物含量增长迅速相符合。在晾晒之后，水分含量的 逐渐下降，有利于豆腐坯体的成型。2.3腐乳前酵期总酸含量的变化

随着腐乳前发酵过程的进行，总酸的含量也在发生变 化，不同时期总酸含量变化见图3。

Fig. 3 Changes of total acid during sufu pre-fermentation process

腐乳在发酵过程中由于微生物的作用，会分泌酶系，导 致总酸的产生，而在前酵过程中，总酸主要来源就是乳酸

菌代谢的作用，产生乳酸、醋酸、琥珀酸等有机酸[22]。由图3 可知，总酸含量在整个腐乳前酵期处于一个增长的过程， 由白坯的0.089 g/100 g上升到蘸料后腌坯的0.385 g/100 g。 尤其在毛霉发酵结束后，含量大幅度增长，考虑是因为水 分含量的减少和代谢的积累导致总酸含量上升。2.4腐乳前酵期氨基酸态氮含量的变化

氨基酸态氮的含量是衡量腐乳品质的一项重要指 标，腐乳前酵过程中氨基酸态氮含量变化结果见图4。

pre-fermentation process

由图4可知，在前酵过程中腐乳的游离氨基酸态氮含 量一直处于增长的过程，主要原因是因为在前酵过程中， 微生物不断的生长繁殖，尤其是毛霉的不断繁衍，产生了 蛋白酶等一系列代谢产物，在酶系的作用下，蛋白质不断 的降解，导致游离氨基酸态氮含量不断上升，使得游离氨

基酸态氮的含量由白坯的0.014 7 g/100 g上升到蘸料后腌 坯的0.32 g/100 g。

2.5腐乳前酵期水溶性蛋白含量的变化

采用凯氏定氮法测定腐乳前酵期不同阶段的水溶性 蛋白含量，结果见图5。

Fig. 5 Changes of water-soluble protein content during sufu

pre-fermentation process

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如图5所示，在前酵期腐乳的水溶性蛋白含量逐渐上 升，这是由于毛霉等微生物在前酵过程中不断分泌蛋白酶， 蛋白酶加快了豆腐坯体中蛋白质的降解，使得水溶性蛋白 含量不断上升，由白坯的3.07 g/100 g上升到蘸料后腌坯的 10.23 g/100 g。而在前酵后期，由于食盐、白酒的作用，降低

了菌株和蛋白酶的活性[23]，导致蛋白质降解速度减缓，后 期水溶性蛋白含量增长缓慢。2.6腐乳前酵期游离氨基酸含量的变化

对腐乳前酵过程中不同时期的游离氨基酸含量进行 测定结果见表1，总量变化见图6。

表1腐乳前酵期游离氨基酸含量的变化

Table 1 Changes of free amino acids content during sufu pre-fermentation process

mg/kg

游离氨基酸天门冬氨酸(Asp)苏氨酸(Thr)丝氨酸(Ser)谷氨酸(Glu)甘氨酸(Gly)丙氨酸(Ala)胱氨酸(Cys)缬氨酸(Val)蛋氨酸(Met)异亮氨酸（le)亮氨酸(Leu)酪氨酸(Tyr)苯丙氨酸(Phe)组氨酸(His)氨酸(Lys)脯氨酸(Pro)

总量

白坯

发酵1 d

发酵2 d

发酵3 d

晾晒1 d

晾晒 2,d

腌坯

蘸料后腌坯

33.73

10.0343.5372.7312.0011.4442.5220.544.742.086.003.887.4595.40219.1110.14595.34

28.919.5341.2068.5712.0311.6239.2917.835.171.316.154.376.56102.90186.2212.03553.70

26.337.2569.1455.0014.8557.2064.8543.4612.318.2820.5312.3315.70206.3397.9529.72771.19

53.65111.6041.40161.9733.69190.2187.38104.0715.1547.5089.8854.5772.28206.77108.5087.541 466.15

206.93437.99157.25440.59104.85554.13184.61270.9941.25136.33251.10140.23188.35468.14309.39792.624,684.75

354.38349.18100.39974.10156.84923.90405.67559.00146.00228.00395.30135.85262.46457.33420.64476.826345.9

405.37291.84114.293,203.27554.301625.16707.711,088.91294.78660.991,093.43513.20490.95650.701,274.05547.0913 516.03

591.76507.59291.052,053.46225.26949.09578.12746.34186.62343.50710.43308.14270.81648.38690.89630.709 732.13

W)

瀣滅槭磐

14 000 -12 000 -10 000 -8 000 -6 000 -4 000 -2 000 -0 -

长，从白坯的595.34 mg/kg增长到腌坯期的13 516.03 mg/kg，尤其是谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸以及赖氨酸含量增 长迅速(表1)，在后阶段含量有所下降，分析是腌坯添加了 辣椒、花椒等辅料后，游离氨基酸含量占总质量的比重下 降，同时微生物活性低导致游离氨基酸的积累不足，使得 游离氨基酸含量有所下降。3结论

牟定腐乳前酵过程中，菌落总数、芽孢杆菌数以及霉 菌和酵母的数量在晾晒期达到数量最高值分别为9.11 lg (CFU/g)、8.87 lg (CFU/g)和7.77 lg (CFU/g)，乳酸菌数量在

图6腐乳前酵期游离氨基酸总量的变化

Fig. 6 Changes of total free amino acids content during sufu

pre-fermentation process

腌坯期达到最高值8.28 lg(CFU/g)，而后均呈现下降趋势。 而水分含量在初期变化不大，在77%左右波动，而后逐渐 减少。总酸、氨基酸态氮及水溶性蛋白含量均呈上升的趋势， 分别由白坯的0.089 g/100 g、0.014 7 g/100 g、3.07 g/100 g 升高 到蘸料后腌坯的 0.385 g/100 g、0.32 g/100 g 和 10.23 g/100 g， 游离氨基酸含量在腌坯期达到最高为13 516.03 mg/kg。

菌落总数、芽孢杆菌数、乳酸菌数以及霉菌和酵母的 数量均呈现先升高后降低的趋势，总体比白坯时有明显的 增加。总酸、氨基酸态氮、水溶性蛋白以及游离氨基酸的含

风味是腐乳品质的一项重要指标，氨基酸对于腐乳的 风味有着巨大的贡献，尤其是部分氨基酸本身就具有一定 的鲜味[24]。在腐乳的前酵过程中，氨基酸的生成是由于微生 物的生长繁殖，导致蛋白酶和肽酶的含量也不断上升，在 酶的作用下，使得豆腐醅中的大豆蛋白被分解成短肽和游离 的氨基酸。由图6可知，前阶段的游离氨基酸的含量逐渐增

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量也比白坯时有显著增加。由此可推断总酸、氨基酸态氮 等理化性质的变化与微生物的活动有着密切的关系，优 良的菌种对于腐乳前酵期的品质形成具有重要的影响。 通过对腐乳前酵期微生物与理化成分的分析，可以为工业 化生产腐乳提供一定的理论依据。

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