复方磺胺喹恶啉溶液微生物限度检查方法学验证

中国兽药杂志　２０１０，４４（９）：３２—３４／吕小虎，等　复方磺胺喹嗯啉溶液微生物限度检查方法学验证　吕小虎，马泽宁，程建国，王仲琴　（山西省兽药监察所，太原０３００２７）　［收稿日期］２０１０—０３—２３［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０（２０１０）０９—００３２—０３［中图分类号】Ｓ８５９．７９５　［摘　要］　建立了复方磺胺喹嗯啉溶液的微生物限度检验方法。采用薄膜过滤法，通过固定的　冲洗量并观察试验菌回收率来确定适宜的检验方法。结果表明，样品在冲洗量为５００　ｍＬ时对细　菌、霉菌无抑制作用。复方磺胺喹嗯啉溶液微生物限度检查应采用薄膜过滤法，冲洗量为５００　ｍＬ。　［关键词］　复方磺胺喹嗯啉；微生物限度；薄膜过滤法　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｌｉｍｉｔ　Ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｓｕｌｆａｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＬＶ　Ｘｉａｏ—ｈｕ，ＭＡ　Ｚｅ—ｎｉｎｇ，ＣＨＥＮＧ　Ｊｉａｎ—ｇｕｏ，ＷＡＮＧ　Ｚｈｏｎｇ—ｑｉｎ　（ＳｈａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇ，Ｔａｉｙｕａｎ　０３００２７；Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｌｉｍｉｔ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｓｕｌｆａｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｉｔｈ　ａ　ｆｉｘｅｄ　ｆｌｕｓｈ　ａｍｏｕｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｆｌｕｓｈ　ａｍｏｕｎｔ　ｗａｓ　５００　ｍＬ，ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｄｉｄｎ’ｔ　ｈａｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｍｉｌｄｅｗ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｌｉｍｉｔ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｓｕｌｆａｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｓｈｏｕｌｄ　ｕｓｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｆｌｕｓｈ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　５００　ｍＬ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｓｕｌｆａｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｌｉｍｉｔ；ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　复方磺胺喹嗯啉溶液为磺胺类药物中专供治　（Ｆ）９８００１］、黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］，以上菌种　均由中国菌种保藏中心提供。　１．１．３培养基营养琼脂培养基（０６０９０４）、营养　肉汤培养基（０８０７１０）、硫乙醇酸盐流体培养基　（０６０３１５）、玫瑰红钠琼脂培养基（０６０５０８）、改良马　丁培养基（０５１１１６）、改良马丁琼脂培养基　（０６０６２１），以上培养基均由中国药品生物制品检定　疗球虫病的药物。根据《中国兽药典））２００５年版一　部要求，本文对复方磺胺喹嗯啉溶液微生物限度检　查的方法进行了考察并对建立的检查方法进行了　验证。　１材料与方法　１．１　试验材料　１．１．１　供试品　复方磺胺喹嗯啉溶液，由山东华　尔康兽药有限公司提供，规格为１００　ｍＬ：磺胺喹嗯　啉２０　ｇ＋甲氧苄啶４　ｇ，批号为０７０４０２。　１．１．２　验证用菌种…　枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ　（Ｂ）６３５０１］、金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］、　大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］、白色念珠菌［ＣＭＣＣ　所提供。　１．１．４仪器ＨｒⅣ一２０００Ａ型集菌仪，杭州高得　泰林医疗器械有限公司；ＳＰＸ一２５０Ｂ—Ｚ型生化培　养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。　１．２方法采用薄膜过滤贴膜法¨Ｊ。　１．２．１　细菌、霉菌和酵母茵计数按照《中国兽药　作者简介：吕小虎Ｉ（１９７５年一），硕士，主要从事微生物安全技术研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｘａ８＠１６３．ｔｏｍ　２０１０，４４（９）：３２～３４／￣ｄ＇虎，等　中国兽药杂志　典｝２００５年版一部微生物限度检查法进行细菌、霉　菌、酵母菌计数的方法学验证及菌落计数。　１．２．２菌液制备Ｈ　接种金黄色葡萄球菌、大　肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至１０　ｍＬ营　养肉汤中，３５＇Ｅ～３７℃培养ｌ８～２４　ｈ，取此培养液１　ｍＬ加９　ｍＬ　０．９％无菌氯化钠溶液，采用１０倍系列　稀释至ｌ０。。～１Ｏ～，使菌数约为５０～１００　ＣＦＵ／ｍＬ。　接种白色念珠菌的新鲜培养物至１０　ｍＬ改良马丁　系列稀释至１０一～１０～，使菌数约为５０～１００　ＣＦＵ／ｍＬ。结果如表１所示。：　１．２．３供试液制备本品为抑菌型药物，直接采　用薄膜过滤法。　１．２．４验证方法试验组　］：取供试液１　ｍＬ薄　膜过滤，冲洗液为ｐＨ　７．０氯化钠一蛋白胨缓冲溶　液５００　ｍｌＭ膜，在最后一次冲洗液中加入无菌的　１％对氨基苯甲酸溶液５　ｍＬ和试验菌。取出滤膜，　菌面朝上，放于培养基上，培养。　样品组　］：取供试液１　ｍＬ薄膜过滤，冲洗液　培养基中，２３＂Ｃ～２８￣Ｃ培养２４～４８　ｈ，取此培养液１　ｍＬ加９　ｍＬ　０．９％无菌氯化钠溶液，采用１０倍系列　稀释至１０～～１Ｏ～，使菌数约为５０—１００　ＣＦＵ／ｍＬ。　为ｐＨ　７．０氯化钠一蛋白胨缓冲溶液５００　ｍＬ／膜，在　最后一次冲洗液中加入无菌的ｌ％对氨基苯甲酸溶　液５　ｍＬ。取出滤膜，菌面朝上，放于培养基上，培　养。阳性对照组　ｌ　Ｊ：取小于１００　ＣＦＵ／ｍＬ的试验　接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基　中，２３℃～２８℃培养５—７　ｄ，加３～５　ｍＬ的０．９％无　菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取１　ｍＬ菌　液加９　ｍＬ的０．９％的无菌氯化钠溶液，采用１０倍　表１　复方磺胺喹嗯啉钠溶液活菌预试验　——菌１　ｍＬ薄膜过滤。取出滤膜，菌面朝上，放于培养　基上，培养。　稀释剂对照组ｎ　Ｉ２］：取冲洗液ｐＨ　７．０氯化　活菌计数（ＣＦＵ／ｍＬ）　钠一蛋白胨缓冲溶液５００　ｍＬ／膜薄膜过滤，在最后　次冲洗液中加入无菌的１％对氨基苯甲酸溶液５　ｍＬ和试验菌。取出滤膜，菌面朝上，放于培养基　一上，培养。　进行３次独立的平行试验，并分别计算各试验　菌每次试验的回收率。测定结果如表２所示。　表２　复方磺胺喹嗯啉钠溶液（薄膜过滤法）试验菌回收率测定　２结果　组平均菌落数）／菌液组的平均菌落数×１００％。　按照《中国兽药典｝２００５年版一部微生物限度　检查法检验，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽　稀释剂对照组菌的回收率：稀释剂对照组的　平均菌落数／菌液组的平均菌落数×１００％；试验组　菌的回收率＝（试验组的平均菌落数一供试品对照　孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于７０％，　・３４・　中国兽药杂志　２０１０，４４（９）：３２—３４／￣ｄｘ虎，等　所以本品微生物限度检查采用薄膜过滤法，冲洗液　为５００　ｍＬ的ｐＨ　７．０氯化钠一蛋白胨缓冲溶液（在　最后一次冲洗液中加入１％对氨基苯甲酸溶液５　ｍＥ）。　按照《中国兽药典））２００５年版一部微生物限度　检查法进行控制菌（大肠埃希菌）的方法学验证试　验及检查。　２．１　菌液制备　大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的　制备同１．２．２项。　２．２供试液的制备取原液。　２．３验证法分组：取大肠埃希菌供试液１　ｍＬ薄　膜过滤，冲洗液为５００　ｍＬ的ｐＨ　７．０氯化钠一蛋白　胨缓冲溶液（在最后一次冲洗液中加人１％对氨基　苯甲酸溶液），将滤膜取出，放于１００　ｍＬ胆盐乳糖　培养基中，重复两份，其中１份为供试品组，另一份　加入大肠埃希菌１０～１００　ＣＦＵ／ｍＬ作为试验组，另　取大肠埃希菌１０～１００　ＣＦＵ／ｍＬ薄膜过滤，加入胆　盐乳糖培养基１００　ｍＬ中作阳性对照，３５￣Ｃ～３７℃　培养ｌ８～２４　ｈ，取上述增菌液０．２　ｍＬ，加入５　ｍＬ的　４一甲基伞形酮葡糖苷培养基（ＭＵＧ）试管中，置　３５℃～３７℃培养５—２４　ｈ。观察结果（表３）。　表３　复方磺胺喹嗯啉钠溶液大肠埃希菌验证结果　试验菌　大肠埃希菌　（７８　ＣＦＵ／ｍＬ）　阴性菌一金黄色葡萄　球菌（６１　ＣＦＵ／ｍＬ）　未检出　阴性菌对照组：取供试液（１：１０）１０　ｍＬ薄膜过　滤，冲洗液为５００　ｍＬ的ｐＨ　７．０氯化钠一蛋白胨缓　冲溶液，在最后一次冲洗液中加入ｌ％对氨基苯甲　酸溶液和金黄色葡萄球菌ｌ０—１００　ＣＦＵ／ｍＬ作为　阴性菌对照，３５￣Ｃ一３７￣Ｃ培养１８～２４　ｈ，取上述增　菌液０．２　ｍＬ，加入ＭＵＧ试管中，置３５℃～３７℃培　养５—２４　ｈ。观察结果如表３所示。　表３的结果显示，阳性组生长良好，试验组检　出说明本品采用该方法后对大肠埃希菌无抑菌作　用；阴性菌未检出表明该控制菌检验方法的专属性　好，可用于本品。　３讨论　从表２结果可以看出，采用薄膜过滤贴膜法测　定复方磺胺喹嗯啉钠溶液供试品，金黄色葡萄球　菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲　霉的回收率试验均高于８０％，符合验证要求。表３　的结果表明，本品的控制菌大肠埃希菌检查可采用　薄膜过滤法，冲洗量为５００　ｍＬ。　根据上述结果，本品的微生物限度检查应采用　《中国兽药典》微生物限度检查方法中的薄膜过滤　法进行，薄膜过滤的供试品溶液的量为１０　ｍＬ　（１：１０），细菌数、霉菌和酵母菌数冲洗量为５００　ｍＬ，控制菌大肠埃希菌的冲洗量为５００　ｍＬ。　现行《中国兽药典》及现行的国家标准所列的　微生物限度检查方法均笼统，药品常有抑菌现象，　这就必然造成检验结果出现假阴性的情况。因此，　建议对每个品种的微生物限度检查方法应详细描　述并写人标准中。　参考文献：　［１］　中国兽药典委员会．中国兽药典一部［Ｍ］．北京：中国农业出　版社，２００５：附录７９．　［２］王英．医学微生物实验室菌种的保存和保管［Ｊ］．海南医学　院学报，２００６，１２（１）：５７—５８．　［３］　应国红．１８种中成药污染细菌的回收率试验［Ｊ］．江西中医学　院学报，２００５，１７（３）：６５．　［４］　杜娟．三高茶的微生物限度检查方法验证研究［Ｊ］．中国药　事，２００６，２０（３）：１５６．