瑞香狼毒生物农药成分提取条件优化

Ｉ唧草业科学　总第２３１期　ＣＡＯ　ＸＵＥ　２０１７年第２期瑞香狼毒生物农药成分提取条件优化　尹卫，李小安，杨国柱　，张承胜，熊丽丽，严晓霞　西宁８１００１６）　（青海省青海大学生态环境工程学院，青海摘要：采用超声醇提的方法对瑞香狼毒（Ｓｔｅｌｌｅｒａ　ｃｈａｍａ￣ｓｍａ　Ｌ．）中具有代表性的总黄酮进行提取，通过开展超声时间、　超声功率、料液比、乙醇浓度４个因素单因素试验和正交试验探索狼毒总黄酮提取的最佳提取条件。数据分析得到显著（Ｐ＜　０．０５）影响狼毒总黄酮提取的因素分别为：乙醇浓度＞超声时间＞料液比＞超声功率，其中最优提取条件为超声时间２０　ｍｉｎ，　超声功率２４０　Ｗ，料液比１／１０，乙醇浓度８０％。　关键词：瑞香狼毒；总黄酮；最佳提取条件；药效初探　中图分类号：ＴＱ４６４　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３—８４０３（２０１７）０２—００５８—０５　Ｄ０Ｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—８４０３．２０１７．０２．０１　１　瑞香狼毒（Ｓｔｅｌｌｅｒａ　ｃｈａｍａ￣ｓｍａ　Ｌ．）为瑞香科狼　毒属植物，又称西北狼毒、断肠草等，广泛分布在　创造正反馈，提高其扩散能力　卜　。　黄酮类化合物又称黄酮体、黄碱素，在生理学、　医学和营养学上具有一定的应用价值，国外学者对　瑞香狼毒进行了理论化、系统化研究，从瑞香狼毒　我国西北、西南、东北等地区。资源极其丰富，其　味苦性平，全草有毒且具异味，其根可入药，具有　逐水祛痰、破积杀虫之功效　。　中分离得到了２３个单体化合物，其中１１个具有抗　ＨＩＶ病毒作用，７个具有抗癌作用¨　。瑞香狼毒　总黄酮对蚊虫、蟑螂、螨虫等昆虫具有较高驱避活　性和杀虫效果　－２０］。　以现代科学研究为基础，开发利用其活性物质，　狼毒生长的土壤相较于周围土壤倾向于累积更　多的有机质，具有更高的无机氮和微生物生物量，　狼毒在空间上的蔓延和斑块化分布将导致养分的　“肥力岛”形成，而狼毒可能利用其上富集的养分，　既能抑制瑞香狼毒繁殖蔓延，控制草场退化，保护　生态环境，又能合理利用自然资源，使瑞香狼毒　收稿日期：２０１６—１０—１８　“变害为宝”。因此，关于瑞香狼毒的药效鉴定、活　性成分研究和提取活性成分技术探究，对今后资源　的合理利用和草原生态环境的保护都有极为重要的　指导意义。　基金项目：青海大学大学生科技创新基金项目（２０１３一ＱＸ一２３）；　国家科技部农业科技成果转化资金项目　（加１４ＧＢ２Ｇ２０ｏ０６３）；青海省科技厅项目（２ｏ１５一ｚｊ一　７１３）资助　作者简介：尹卫（１９７８一），男，硕士，助教，现从事豆科牧草选　育及牧草种质资源开发利用、生态环境保护工作。　为此，本研究进行了青海省瑞香狼毒有毒生物　农药有效成分的提取工艺及药效评价试验，旨在为　通讯作者：杨国柱（１９６ｏ一　），男，本科，教授，现从事高　海拔地区牧草遗传育种与三江源植物资源开发利用　等研究工作。　今后瑞香狼毒的开发利用提供理论依据。　园ＩＩ　墨—口　瑞香狼毒生物农药成分提取条件优化（’Ａ（）ＸＵ　Ｅ　１．２．４正交试验：试验药品、试验材料、试验流　１材料与方法　１．１　试验材料、仪器、药品　程、标准ｆｆｆｌ线制作和检测方法　单　索试验的卡Ｉ　ＩＪ　方　法・敛　１１．交试验水平殴计根据　『夫１索试验结　没汁　１．２．５总黄酮提取率的反推计　Ｗ（％）＝Ｍ／ｇ＝Ｖ　１（２１．９４ｌ３×Ｖ　ｌ×Ａ＋　０．０１９７）／３０００×１００％　（１）　１．１．１　试验材料狼毒样　：瑞香狼谢全株经清　洗Ｉ　ｊ干，粉　箭Ｊ『１。　１．１．２试验仪器：粉碎机：卜海『ｆ　崩定粮油检　测仪器ｒ　ＪＦＳＩ）一１００；紫外分光光度汁：坨尼柯（Ｉ　Ｍ一提取』ＪＩ的总战例可的质　（ｇ）；Ｖ，一减Ｊ　ｌ　过　海）仪器仃限公・习ｕＶ一２８０２Ｈ型；数控超声波清洗　：昆ＬＩｊ　ｍ趔Ｊ　仪器有ｌ５艮公州ＫＱ一６００ＤＥ等。　１．１．３　试验药品：　丁标准品、ｌ尢水乙醇、氰氧　化钠、石油雠、镁粉、硝酸　、哑硝酸钠等均为分析纯、、　１．２试验方法　１．２．１　总　酮物的提取：准确称取十燥的狼赢　粉３　ｇ．按．｝！（｛试验设汁加入相应浓度和体积的乙　醇；置丁超声波清洗仪ｒｆｆ’　２５℃的泓度下在相心　的功率、时　１－超声提取，减压过滤，滤液经过　｝ｆ｛Ｉ醚萃取，取　崔取液３　ｒ　１浓缩得到狼　根乙醇提　取物，提取物ｌＩｌ加入ｌ５　ｒ¨Ｉ蒸馏水，４５　水浴加热　３０　ｍｉｎ，静　至窀温，过滤，弃去滤液，眶复３次，　挥ｔ　溶剂，即　总黄酮成分　其巾总黄酮监测参照　丁标准ｆＨ１线ｉ１Ｉ疗法　、　１．２．２　丁标准｝｝｝Ｉ线绘制：精密称取ｌｌ５℃十　燥　重的无水，　丁４．７５　ｍｇ，用５０％乙醇定容于　２５　ｍ１容量轨『ｆｆ＿Ｉ　摇匀．．精密最取ｆ：述溶液０．１、　０．２、０．３、０．４、０．５、０．６　０．７　ｍ１分别韫于２５　ｍｌ　窬　瓶厂ｒＩ，精密培取５％　硝酸钠溶液０．３ｎ　１加入各　瓶，摇匀，放　６　ｎ］ｉｎ；ＪＪｌＩ　ｌ０％硝酸销溶液０．３　ｎ　Ｊ，　摇匀，放背６　ｌｌｌｉｎ，力ｌｌ　４『１１Ｉｌｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液，　分别用５０％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，放旨　１０　Ｉｌｌｉｌ１，置比色Ｉ１１１－中，在５ｌ０　ＩｌｌＩＩ波长处测定吸收值　、　以吸收度对浓度作直线　归，得同归力‘程：Ａ＝　一０．０００９＋０．１２６６Ｃ，Ｒ　＝０．９９９８。（ｃ单ｆ　：ｍｇ／Ｉ　）　１．２．３　素试验水平没计（　表１）　表１　单因素水平表　＼因素　超声时间　超声功率　料液比　乙醇浓度　水平＼＼Ａ（ｍｉｎ）　Ｂ（Ｗ）　Ｃ（ｇ／ｖ）Ｄ（％）　ｌ　１０　２４０　ｌ／６　３５　２　ｌ５　３００　Ｉ／８　５０　３　２０　３６０　１／１０　６５　４　２５　４２０　ｌ／１５　８０　５　３０　４８０　ｌ／２０　９５　滤（３次）过滤液总体积ｍｌ；ｇ一试验『｝Ｉ所称取的狼　毒样　质：硅（ｇ）。　２结果与分析　２．１　单因素试验结果　２．１．１　超声时问埘狼毒总黄刚提取效　的影　响：称取狼毒样品３　ｇ，共计１５份，加入１８－，ｄ３５％　乙醇，颅浸２４　ｈ后进行超声提取，超　时问分刖为　ｌ０、ｌ５、２０、２５、３０　ＩＩｌｉｌ１后滤取上清液，』ＪｌＪ　２５　Ｉｌ１１　油醚萃取１２　ｈ，重复苹取３次，合许萃取液　根据　ｌ。２．４　法进行吸光（ｆ［测定，南标准曲线方　Ｉ公式　（１）得到总黄酮提取牢，结果如　１所示　１数据可以看…狼毒黄　提取率随　ｊｉ芏ｉ声　时问增ＪＪＩｌ　现先提高后’Ｆ降的趋势，其巾超　时问　为２０　ｍｉｎ　ｆ『’ｆ黄酮提收率显著（Ｐ＜０．０５）高ｆ　他　处　组，陔处理　黄酬提取葺墨达到ｌ９．４４％，较最低　组捉离Ｊ　５．３４个　分点　其巾住越声　时Ｊ１１Ｊ提Ｉ门到　２５　ｎｌｉｎ之后提取牢不仔　著（Ｐ＞０．０５）变化　，‘ｆｍ　鼗ｚ翥　ｏ０ｏ　善　ｏ　。　。．　值　毒∞。０　５。。　０Ｏ０　０．００　５　ＯＯ　１０．００　１　５（１０　２Ｏ　ＯＯ　２５　００　３０　０Ｃ　３Ｓ　０Ｏ　超声时间　ｍＩｎ）　图１　超声时间对提取率的影响　注：数据宥怀小写字母均不同表示处理问　异显著　（Ｐ＜０．０５），合有相同字母表示差异不显蔷（Ｐ＞０．０５）　２．１．２超声功牢对狼毒总黄　提取效果的影　响：具体试验步骤参照２．１．１的步骤，其巾将超声　功率设置　２４０、３００、３６０、４００、４２０、４８０Ｗ　根　＿衄草业科学　总第２３１期　３５　ｏ０　ＣＡ（）Ｘｔ　ＪＥ　２０１７年第２期据１．２．４方法测定吸光值，由标准曲线方程和公式　（１）得到总黄酮提取率，结果如图２所示。　３０　００　提３０　ｏ０　取２ｓ　００　塑　平２Ｏ００　韫２５０ｏ　驭　蜜２Ｏ－ｏｏ　均　值１５・００　％１Ｏ・ｏ０　５．ｏ０　０．００　平　均ｌ５　０ｏ　值　一ｌＯ０ｏ　２０　４０　６ｏ　％　）Ｗ　己群浓度（％）　０　ｏ０　图４　乙醇浓度对提取率的影响　）　１００　２Ｃ０　３００｜００　５００　ｅｅ　村声功章　Ｗ　Ｊ　图４显示乙醇浓度显著（Ｐ＜０．０５）影响狼毒总　图２　超声功率对提取率的影响　黄酮的提取效果。其中在乙醇浓度为６５％时总黄酮　超声功率对狼毒总黄酮提取率的影响呈现先增长　提取率平均值为２９．２２％，高出乙醇浓度３５％处理组　１４．５７个百分点。　２．２　正交结果　后下降的趋势，当提取功率为３００　Ｗ时，提取率最高　达到２４．３８％，此时提取率显著（Ｐ＜０．０５）高于其他　处理组。当提取功率提高到３６０　Ｗ后，随着功率的进　一正交试验是为了研究不同因素对瑞香狼毒中总黄酮　步提高总黄酮提取率并未出现显著（Ｐ＞０．０５）　提取率的影响，本试验在预浸时间２４ｈ、室温条件下对　料液比、乙醇浓度、超声时间和超声功率等冈素进行四　因素三水平的正交试验，试验设计见表２、表３。　表２正交试验因素水平表　超声时间　超声功率　料液比　Ａ（ｍｉｎ）　１　ｌ５　变化。　２．１．３料液比对狼毒总黄酮提取效果的影响：　具体试验步骤参照２．１．１的步骤，其中将料液比设置　为１／６、１／８、１／１０、１／１５、１／２０。根据１．２．４方法测　定吸光值，由标准曲线方程和公式（１）得到总黄酮　提取率，结果如罔３所示。　３Ｓ　ｏ０　乙醇浓度　Ｄ（％）　５０　６５　８０　Ｂ（Ｗ）　２４０　３ｏ０　３６０　Ｃ（ｇ／ｖ）　１／ｌ０　提３０　ｏ０　职２５　ｏ０　垂　平２０　００　———＿　２　３　２０　２５　ｌ／ｌ５　ｌ／２０　均　值１５　００　％１０ｏ０　Ｗ　表３　正交试验组合及其结果　０ｏ０　０　５　ｌ０　１５　２０　２５　抖猜比（１：ｘ）　图３料液比对提取率的影响　南图３可以看出随着料液比逐步增大，总黄酮　提取率出现先上升后下降，再趋于平衡的变化，其　中在料液比为１／１５时总黄酮提取率最大为２８．１３％，　显著（Ｐ＜０．０５）高于１／６、１／８、１／１０处理组，单　因素表明最佳料液比为１／１５。　２．１．４乙醇浓度对狼毒总黄酮提取效果的影　响：具体试验步骤参照２．１．１的步骤，其中将乙醇　浓度分别处理为３５％、５０％、６５％、８０％、９５％。　根据１．２．４方法测定吸光值，由标准曲线方程和公　式（１）得到总黄酮提取率，结果如图４所示。　圃ｍ　表４正交试验结果分析　『ｆｆ丧３　ｉｔＪ‘　，按照极差ｌ｛的大小，影响瑞乔狼　毒总黄酬提取率的　素主次顺序为Ｄ＞Ａ＞Ｃ＞Ｂ，即　乙醇浓度＞趟ｊＩ　时间＞料液比＞趟　功率，最件的　组合条什　Ａ，ｌ｛　Ｃ　Ｄ　。综合考虑以Ｉ　索，同时考　虑经济成小，减少电力消耗和提取剂乙醇的使用量，　以Ａ　Ｂ　Ｃ．１）　【ＪＩ】超声时问为２０　Ｉｌｌｉｎ，趟声功率为　２４０　ｗ．料液卜匕ｌ／１０，乙醇浓度为８０％时是瑞香狼　毒总黄州的　提取条件　、　过试验测定住此提取　条件卜瑞　狼海生物农药有效成分总黄酮的提取牢　叮达２９．６８％，　＿ｊ吴晓亮等　用索氏提取法和树脂柱　层析法『ｌ１瑞香狼毒总黄酮提取物ｌＩ１黄酬　量分别为　１９．２０％和２４．１８％相比，超声波浸提法‘ｊ石油醚萃　取法＿卡Ｈ结合的岛效超声波提取法比川索氏提取法和　树脂柱层析法的提取率分别高…ｌ０．４８％和５．５％。　３结论与讨论　交试验结果表明超声时ｒＨ】为２０　ｉｎｉｎ，超声功　率为２４０　，料液比１／１０，乙醇浓发为８０％时是瑞　香狼毒总黄刚的最佳提取条件。　据报道，。ｆ宁海省天然草场瑞香狼毒　长面积约　７．３×１０　ｈｔｎ　以　，狼毒在草原迅速繁衍的原因是因　为狼毒具有较　的耐旱性、有毒性和无强烈的竞争　者　，对　Ｉｉ态系统已十勾成重大威胁如果对瑞　香狼毒资源进行综合开发，将提取物『１１的糖类进行　一定的处理后作为：　业川糖，将提取物总黄酮物质　作为，卜物质农药成分等合理开发利川，／ｆ　仅有利于　青海省促进新型产业的发展，增力¨就业等社会效益　和经济效益，　且对瑞香狼毒资源的合理开发会抑　制瑞香狼毒　草场的蔓延和有效降低其对草原的危　害，有利ｆ　｛ｉ念环境的保护，增加环境效益。　瑞香狼毒生物农药成分提取条件优化　参号艾献　［Ｉ］刘桂芳，付玉芹，候凤飞，王连，王升辉，李明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